背景介绍Wnt基因广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物,并且在不同物种具有高度的保守性。经典Wnt信号通路参与多种生理和病理机制,调控细胞增殖、分化、细胞极性、迁移、凋亡等一系列重要过程,尤其在各种干细胞、肿瘤细胞等生命活动活跃的细胞中发挥关键作用。迄今研究表明,经典Wnt信号功能失调与多种癌症的发病机制密切相关,不仅参与恶性肿瘤的发生,而且促进其发展和转移,包括乳腺癌、胃癌、食管癌、结肠癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤等。上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)指上皮样细胞在特定的生理或病理环境中向间质样细胞转变分化的现象,其逆向过程称为间质-上皮转化(mesenchymal epithelial transition,MET)。生理性EMT/MET多见于胚胎发育和组织愈合修复,而病理性EMT主要参与某些组织的纤维化及恶性肿瘤细胞的转移,是肿瘤细胞局部浸润和转移的关键步骤。在EMT过程中,上皮起源的细胞失去其上皮样表型并逐渐获得间质样细胞表型,即细胞极性消失,细胞间的紧密连接减少,黏附能力降低,单层细胞结构不能维持,细胞的迁移、游走能力增加,从而表现出侵袭转移能力的增强。EMT细胞的典型分子表型变化主要是上皮细胞标志物E型钙黏蛋白(epithelium-cadherin,E-cad)等表达降低,而N型钙黏蛋白(N-cadherin,N-cad)、波形蛋白(Vimentin,Vim)等间质细胞标志物表达升高;且多种转录因子也相应呈现一系列变化。EMT受多种分子信号通路调控,目前研究表明,经典Wnt信号通路(又称Wnt/β-catenin通路)参与某些生理和病理的EMT/MET的调节。如在小鼠肾小管发育中,敲除Wnt基因可有效阻断间质样细胞迁移和组织局部肾小管上皮细胞的形成,采用基因敲除的方法干扰Wnt/β-catenin信号通路,显著影响EMT介导的肿瘤转移病灶的发生,显示了该通路在肿瘤转移中的重要意义,提示针对Wnt/β-catenin信号通路的靶向性治疗具有阻断肿瘤转移的潜在意义。目前已证实Wnt/β-catenin信号通路失调是结肠癌发病的重要诱因,该通路是否促进结肠癌的浸润与转移尚需进一步研究。目的本实验选用体外培养的结肠癌细胞系HCT116细胞作为实验对象,利用基因重组蛋白Dkk1和Wnt3a分别抑制和激活Wnt/β-catenin信号通路,采用细胞划痕实验和实时荧光定量聚合酶链反应(polimerase chain reaction,PCR),观察Wnt/β-catenin信号通路活性改变对细胞迁移的影响以及对EMT特征性分子和相关转录调控因子基因表达的影响,从而确定Wnt/β-catenin信号通路对结肠癌细胞EMT的调控作用。方法1.HCT116细胞的体外培养。结肠癌细胞系HCT116购自中国科学院上海生命科学学院细胞库,用含10%胎牛血清(Fetal bovine Serum,FBS)的My Coy’s 5a培养基制备单细胞悬液,以1×105/ml密度接种(5ml/瓶),置于37?C,5%CO2和饱和湿度的细胞培养箱培养,定期观察。当细胞生长至大约覆盖培养瓶底部90%时,按照1:5的比例进行细胞传代培养。2.实验分组。HCT116细胞分为三组分别是:(1)对照组:HCT116细胞;(2)抑制剂组:HCT116细胞+Dkk1(100ng/ml);(3)激动剂组:HCT116细胞+Wnt3a(40ng/ml)。采用常规培养液制备HCT116的单细胞悬液,以1×106/孔的密度接种于六孔板,每组设3个平行孔。24h后待细胞贴壁生长时开始上述抑制剂和激动剂的处理。3.细胞划痕实验。HCT116细胞培养24h后,细胞贴壁生长,覆盖大约80%的培养板表面。用无菌枪头在六孔板每孔中央沿直径方向画一条粗细均匀的划痕,仔细刮去划痕线右侧所有的细胞,保留左侧细胞完好。弃去培养基并用PBS冲洗3次除去漂浮的细胞,换成含2%FBS的My Coy’s 5a培养基,并按上述分组所示加入Dkk1(100ng/ml)或Wnt3a(40ng/ml)。此时记为0h,使用倒置显微镜在每孔中沿划痕线从上至下划分为8个连续的观察视野,分别在0h、12h、24h、48h时,观察各个视野中的细胞迁移情况并采集图片,将得到的细胞图像数据用Image Pro Plus 6.2进行分析处理,分别计算对照组、抑制剂组和激动剂组越过划横线的细胞数。4.细胞周期检测。HCT116细胞培养24h后,细胞贴壁生长;按照方法2分组处理48h后,收集3组细胞,PBS清洗3次,用冷无水乙醇固定过夜,离心后加入碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)和RNA酶混合的DNA染色溶液(每样本200μl)重悬混匀,室温下避光孵育30min后,PBS清洗3次,用流式细胞仪检测细胞周期。结果采用细胞周期拟和软件Mod Fit进行分析。5.实时荧光定量PCR检测Wnt信号通路相关基因、EMT特征性分子及转录调控因子的基因表达变化。采用总RNA提取试剂盒分别提取处理48h后对照组、抑制剂组和激动剂组的总RNA,使用Nanodrop精确测定RNA浓度和纯度,各样本以等量的总RNA反转录为c DNA。采用实时荧光定量PCR法检测各组基因表达变化,包括:Wnt信号通路相关基因β-catenin,Axin2,C-myc,Wntless;EMT特征性分子的基因E-cad,N-cad,Vim;参与EMT的关键转录调控因子基因Slug,Snail,ZEB1,ZEB2,Twist,MMP2,MMP3。β-actin为内参基因,ROX为加样参照荧光。根据-σTT分别计算抑制剂组和激动剂组与对照组基因表达量的相对比值。6.统计学处理。上述实验均重复3次,使用SPSS10.1统计软件,采用t检验法分别将抑制剂组和激动剂组与对照组进行分析比较,检验水准α=0.05。结果1.HCT116细胞按1:5传代,呈单层聚集生长,细胞形态为上皮样细胞,呈多边形、卵圆形,细胞增殖能力旺盛,细胞之间连接紧密,胞间没有空隙,连续传代的细胞不出现可识别的形态及生长特性的改变。2.调节经典Wnt信号通路的活性,通过细胞划痕实验可以看出,对照组至24h时才发生明显细胞迁移;激动剂组(Wnt3a-40ng/ml)在12h时就可以观察到细胞迁移;抑制剂组(Dkk1-100ng/ml)在实验观察的48h内始终没有明显的细胞迁移现象。3.调节经典Wnt信号通路的活性,并用流式细胞仪检测细胞周期,结果显示,对照组处于S期的细胞占10.2%±0.45%,抑制剂组处于S期的细胞占9.4%±0.2%,激动剂组处于S期的细胞占11.1%±0.3%。统计学分析显示,抑制剂组和激动剂组分别与对照组的S期细胞相比,差异无显著性。4.实时荧光定量PCR检测结果显示,采用Wnt3a(40ng/ml)处理48h显著激活Wnt/β-catenin信号通路,表现为经典Wnt信号通路的关键基因β-catenin和相关调控基因Wntless的表达显著上调;同时,上皮细胞标志物E-cad表达下调,而间质细胞标志物N-cad、Vim等表达显著上调。当采用Dkk1(100ng/ml)抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性时,上述基因表达呈现相反的变化。统计分析显示,抑制剂组和激动剂组分别与对照组相比,差异具有显著性(p<0.05)。5.实时荧光定量PCR检测结果还显示,EMT相关的转录调节因子也出现明显变化。当Wnt3a(40ng/ml)激活Wnt/β-catenin信号通路时,转录调节因子Snail、Slug、ZEB1、Twist、MMP3表达均上调。相反,当采用Dkk1抑制Wnt/β-catenin信号通路时,上述基因表达下调。统计分析显示,抑制剂组和激动剂组分别与对照组相比,差异具有显著性(p<0.05)。结论1.体外培养条件下,经典Wnt信号通路调节结肠癌细胞上皮-间质转化,激活该信号通络可促进细胞迁移和间质样细胞表型,抑制该信号通路结果相反。2.经典Wnt信号通路对上皮-间质转化的调控作用可能与转录调控因子Slug、Snail、ZEB1、Twist、MMP3相关。