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丹参Salvia miltiorrhiza Bunge为唇形科鼠尾草属植物,载于《神农本草经》,药用部位为根及根茎,具有活血化瘀、通经活络之功效,临床用于治疗冠心病、心绞痛、缺血性脑卒中等疾病,其有效成分主要包括以丹参酮ⅡA为代表的脂溶性萜类化合物和以丹参酚酸B为主的水溶性酚酸类化合物。文献报道,MeJA诱导处理可以使丹参酮ⅡA的含量提高4.5倍,丹参酚酸B的含量提高6倍。然而,MeJA促进丹参酮ⅡA和丹参酚酸B生物合成的机制未得到阐明。我们通过转录组测序技术的方法筛选出了受MeJA诱导上调的转录因子SmMYC2a和SmMYC2b。SmMYC2a的开放阅读框(ORF)长1803个碱基,该ORF编码了一个含有600个氨基酸的蛋白质；SmMYC2b的ORF含1824个碱基,该ORF编码了一个含有607个氨基酸的蛋白质。结构域分析结果表明,SmMYC2a和SmMYC2b都含有bHLH结构域,属于bHLH家族。此外,这两个转录因子还含有保守的JID结构域,可能与JAZ蛋白存在互作。MeJA诱导实验表明,SmMYC2都早期响应MeJA,在0.5 h的时候表达量最高。不同的是,MYC2a在0.5 h以后呈缓慢下降趋势,而MYC2b则在1h就迅速下降到了基值,表明比起SmMYC2b,SmMYC2a可能具有更加广泛的调节作用。亚细胞定位实验结果表明,SmMYC2都定位在细胞核,符合转录因子定位在细胞核的基本特性。为验证SmMYC2在体内的功能,考察其是否能够影响丹参酮和丹参酚酸B的合成。构建了MYC2-RNAi的载体,C58C1农杆菌介导遗传转化丹参发根。QRT-PCR的结果显示,RNAi沉默SmMYC2a/b后,丹参酮类合成途径和丹参酚酸合成途径的基因的表达与对照比均有显著降低。除了共同调控基因CMK, CPS, TPS, PAL, RAS6和CYP98A14, SmMYC2a还影响了HMGR, MCS, GPPS, GGPPS和KSL的表达,SmMYC2b还影响了MK和DXR的表达。含量测定结果表明,在MYC2a-RNAi和MYC2b-RNAi的转基因发根中,萜类化合物丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、二氢丹参酮含量均有不同程度的降低,酚酸类化合物苯丙氨酸、尿黑酸、迭香酸、丹参酚酸A、丹参酚酸B的含量也有显著降低。MYC2a的沉默使得丹参酮ⅡA的含量下降至对照的6.4%,丹参酚酸B下降至对照的23.2%；MYC2b的沉默使得丹参酮ⅡA的含量下降至对照的40.2%,丹参酚酸B下降至对照的5.0%。说明MYC2a和MYC2b都是正调控的转录因子,都对多个酶基因、多条合成途径、多种化合物起到了调控作用,其调控结果是相似的。然而,其影响的关键基因是不完全相同的,表明这两个转录因子在调控丹参有效成分生物合成的机制上存在差异,是不可替代的。为了进一步研究MYC2调控丹参酮和丹参酚酸生物合成的分子机制,扩增了多个关键酶基因的启动子,筛选出包含MYC2结合位点E-box的基因,设计了相应的探针,进行了电泳迁移率实验(EMSA)实验。结果表明,SmMYC2a能够与酚酸类合成途径中的关键基因SmRAS6, SmCYP98A14结合,SmMYC2b能够与SmCYP98A14结合,证明SmMYC2a可能通过调控SmRAS6, SmCYP98A14来影响酚酸类化合物的合成,SmMYC2b可能通过调控SmCYP98A14影响酚酸类化合物的合成。为研究MYC2的激活机制,进行了酵母双杂交(Yeast two hybrid, Y2H)实验。结果表明,SmMYC2a/b和SmJAZ1,SmJAZ2均有很强的互作,证明这两个MYC2是SmJAZl和SmJAZ2的靶标蛋白,且MYC2-JAZ的结合抑制了MYC2对关键酶基因(SmRAS6和SmCYP98A14)的转录激活。综上所述,本研究通过对JA信号关键转录因子SmMYC2调控丹参酮和丹参酚酸合成的功能研究,建立了JA-MYC2-关键酶基因-有效成分的网络,拓展了人们对丹参有效成分生物合成调控的认识,从而为阐明丹参有效成分的合成和调控途径,进而为开展生物合成途径的遗传改造、培育优良品系提供了科学支撑。