近年来,随着枇杷产业不断扩大,其病害问题凸显,尤其是炭疽病。该病主要为害其叶片和果实,发病时叶片和果实将出现褐色病斑,严重时会导致大量果实腐烂脱落、树势早衰、苗木溃变。此外,枇杷的生长发育、采后贮藏和运输过程均会受到该病不同程度的影响,这严重制约了枇杷产业的持续发展。目前,在其他物种上利用抗病基因已成为持久抗病育种的有效途径,但尚无有关枇杷抗炭疽病基因的相关报道。课题组前期从重庆、四川和福建三个地区的枇杷果园中成功分离到四种炭疽病病原菌,分别是胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、尖孢刺盘炭疽菌（C.acutatum）、喀斯特刺盘菌（C.karstii）、西氏炭疽菌（C.siamense）,其中C.gloeosporioides分离频率最高且致病性最强,利用C.gloeosporioides对30个枇杷主栽品种果实进行人工接种抗病性鉴定,筛选出抗病品种‘大洋晚白’（DY）和感病品种‘森尾早生’（SW）。在此基础上,为进一步研究枇杷应答炭疽菌侵染的分子机制,本研究以抗病品种DY和感病品种SW为材料,利用RNA-seq技术分析了枇杷果实受C.gloeosporioides侵染后72 h的基因表达变化,并对植物病程相关蛋白1（PR1）和植物病程相关蛋白4（PR4）进行了克隆、结构和功能分析。主要研究工作及结果如下:1.抗病品种DY和感病品种SW果实应答炭疽菌侵染的转录组分析（1）将C.gloeosporioides接种DY和SW果实0 h和72 h后,共4个样品进行RNA-Seq测序共得到488.36 MB高质量待分析reads。使用Trinity从头组装拼接后,得到116,018条潜在转录本,组装结果N50长度为1,635 bp。从组装出的全长转录本序列中,选取每个基因最长的转录本序列作为Unigene,共获得51,325条。（2）在DEGs中,以|log2Ratio|≥1和q<0.05为阈值,共筛选到14,947个差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）。进一步以|log2Ratio|≥10和q<0.005为阈值,筛选得到451个上调表达的极显著差异表达基因,其中75个与抗病相关,包括几丁质酶基因12个,PR1基因1个,PR4基因1个,WRKY转录因子基因49个和TGA基因12个。（3）接种前抗病DY与感病SW相比共筛选到6,426个DEGs（2,755个上调表达,3,671个下调表达）;接种72 h后抗病DY与感病SW相比共筛选到11,247个DEGs（3,057个上调表达,8,190个下调表达）。将DEGs富集的细胞组分、生物进程和分子功能进行GO分析,发现其主要集中于细胞过程（cellular process）、应答刺激（response to stimulus）等条目中,KEGG通路富集中富集到与抗病相关的通路主要有植物与病原菌互作、植物激素信号转导、苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成等代谢通路。（4）随机选取12个共表达差异基因进行q RT-PCR验证,结果表明各基因表达与RNA-Seq测序结果基本一致,上下调表达趋势相同,只是在差异倍数上与转录组数据有所差别,证明了转录组结果的可靠性。2.Ej PR1与Ej PR4的克隆及表达特性分析采用RACE克隆、生物信息学分析以及q PCR技术得到结果如下:Ej PR1基因全长为731 bp,开放阅读框为561 bp,编码186个氨基酸,Ej PR1蛋白质相对分子质量为21,485.34,等电点5.63,为酸性蛋白;Ej PR4基因全长为753 bp,开放阅读框为447 bp,编码148个氨基酸,Ej PR4蛋白质相对分子质量为15,932.76,等电点5.08,为酸性蛋白。Ej PR1与Ej PR4蛋白分别与蔷薇科苹果PR1与PR4蛋白的同源性最高。对Ej PR1和Ej PR4在DY和SW果实接种C.gloeosporioides 0h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h和120 h后的表达特性进行分析,结果表明,Ej PR1和Ej PR4在抗病品种DY的表达量显著高于感病品种SW,并分别在96 hpi和12 hpi达到峰值,表明Ej PR1和Ej PR4可能参与了枇杷应答炭疽菌C.gloeosporioides侵染的防御过程。3.Ej PR1与Ej PR4的原核表达分析基于Ej PR1与Ej PR4 c DNA序列选取合适的表达载体p ET32a（+）以及宿主表达菌株BL21（DE3）构建原核表达载体,在成功诱导出总蛋白后对其诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度进行优化,获得最适诱导条件为:在0.1 mmol/L的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）条件下,28℃诱导12 h。经可溶性分析显示,Ej PR1与Ej PR4的诱导蛋白主要存在于上清液中,是可溶性蛋白。4.Ej PR1转基因拟南芥的构建及分子检测将扩增得到的Ej PR1 c DNA序列连入带有Ca MV35S启动子的p BI121表达载体内,采用液氮冻融法将p BI121-Ej PR1质粒转入农杆菌GV3101中,获得Ej PR1超表达工程农杆菌。通过蘸花法侵染Col-0野生型拟南芥植株,所得T0代种子通过卡那霉素抗性筛选,共获得9株拟南芥幼苗,经PCR检测全部为阳性苗,最终得到了9株Ej PR1超表达拟南芥植株。