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百香果（Passiflora edulis Sims.）,营养和药用价值高,开发潜力大,不仅果肉具有重要的生物学功能,果皮也有控制血糖、抗高血压、抗炎减脂和保肝护肾等功效。目前的研究报道对于百香果果肉糖酸和一些基础物质含量的研究比较多,而对百香果的果皮、果肉类黄酮等生物活性代谢物质、基因功能和遗传转化的研究比较空缺。为揭示百香果类黄酮代谢相关机制,本研究以中国福建亚热带地区果园的‘福建百香果1号’紫果和‘福建百香果3号’黄果为试验材料。采用分光光度计法对果实发育期间的类黄酮、花青素和原花青素的含量变化进行了测定;采用高效液相色谱-质谱联用测定了芦丁、槲皮素、木犀草素、芹菜素、山奈酚5种黄酮类标品和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷3种花青苷;采用生化法测定了类黄酮代谢途径的关键酶活性:PAL、C4H、4CL、CHS、UFGT和GST;利用百香果转录组和基因组数据筛选出类黄酮代谢有关基因,利用qRT-PCR分析类黄酮代谢途径中相关基因的在两个品种中的差异表达;对百香果的PePAL5基因进行克隆分析,并构建pCAMBIA1301-PePAL5过表达载体和pCAMBIA1302-PePAL5亚细胞定位载体,通过百香果的原位转化和对拟南芥花序侵染对PePAL5进行遗传转化,侵染烟草叶片瞬时表达探究其亚细胞定位。主要研究结果如下:1.‘福建百香果1号’紫果和‘福建百香果3号’黄果的外观品质差异很大,除颜色转化有很明显差异外,黄果单果重更高、光泽感更强,而且更趋近于圆形。紫果果皮中类黄酮、花青素和原花青素含量显著高于黄果。UPLC-MS测定类黄酮和花青素的组分,结果显示芹菜素和山奈酚没有在果实中检测出,其他黄酮类的组分在果皮中均有检测到。黄酮类组分芦丁、木犀草素和槲皮素均在紫果果皮后熟期含量最高,分别为22569.60 ng·g-1、29.19 ng·g-1和35.25 ng·g-1。花青素类的组分在紫果果皮中检测到的含量显著高于黄果果皮,紫果果皮中后熟期花青素的累积含量:芍药素-3-O-葡萄糖苷(9793.08 ng·g-1)＞矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(7341.62 ng·g-1)＞天竺葵素-3-O-葡萄糖苷(511.92 ng·g-1)。类黄酮代谢过程的关键酶的活性和对应结构基因的相对表达量在果皮中也存在差异,在果皮发育中紫果的PePAL2,4、PeC4H1、Pe4CL2,3,7、PeCHS1～3、PeUFGT1和PeGST5,7基因相对表达量要显著高于黄果。PCA相关性分析结果表明C4H、4CL、UFGT和GST酶的活性与百香果果皮类黄酮的差异代谢显著相关,对果皮类黄酮代谢影响较大的基因为PePAL4,5、Pe4CL2,3、PeCHS2和PeGST5,7。2.果肉中黄酮类物质被检测到的含量显著低于果皮,花青素含量较少,尤其是黄果品种;果肉中的黄酮类物质呈现先下降后上升的趋势。果肉中主要类黄酮物质为芦丁,含量为77.33 ng·g-1（紫果果肉后熟期）,另外发现黄果果肉中木犀草素在幼果期具有非常高的含量(134.39 ng·g-1),甚至超过百香果果皮中的最大值。酶活在两个品种的果肉中也有很大差异,特别是PAL酶的活性,在果肉中黄果显著高于紫果（P≤0.001）,与果皮中相反。其他酶活,在不同的时期,两个品种交替占优势地位。qRT-PCR实时荧光定量表达分析,果肉中两个品种差异表达较大的基因有:PePAL1,2、PeC4H、PeCHS1,2,3、PeUFGT2、Pe4CL4,6,7和PeGST3,5,7。PCA分析得到的结果是CHS酶与果肉中多数类黄酮物质代谢积累显著负相关,对黄果果肉幼果期时木犀草素的大量积累正向调控的基因为PeCHS1和PeCHS3,综合分析,在果肉类黄酮代谢过程中起重要作用的基因为PeCHS1、PeCHS2、Pe4CL4、PeUFGT2、PeGST2、PeGST3和PeGST5,在这些基因中类黄酮代谢途径下游基因占大多数。3.本研究成功克隆到‘福建百香果1号’紫果和‘福建百香果3号’黄果PePAL5的gDNA和cDNA序列,序列长度均为2142 bp,编码氨基酸713个。PePAL5的gDNA和cDNA序列一致,无内含子结构。PePAL5P和PePAL5Y的CDS序列具有碱基的差异性,分析比对氨基酸序列的结果表明PePAL5P与‘ZX’基因组序列（ZX.01G0143260）的氨基酸序列完全一致,与PePAL5Y序列的编码的氨基酸有6个差异,均属于酸性亲水性蛋白,PePAL5Y蛋白的元素组成比PePAL5P多了C2H4N2,分子总量和原子数更高,具有更大的等电点、脂肪系数和不稳定系数,但PePAL5P的负电荷残基比黄果多一个。PePAL5P和PePAL5Y的氨基酸结构相同,均无信号肽和跨膜结构,定位在细胞质。PePAL5Y的苏氨酸（Thr）磷酸化的个数比紫果的PePAL5P多一个,蛋白的二级结构和三级结构存在细微差异。对‘ZX’基因组5个PAL基因的结构进行分析显示存在一个较长的序列ZX.01G0129760含有很多个内含子序列,其他序列编码氨基酸的个数在701～716之间,存在0～2个内含子,含PAL保守活性位点。Motif分析显示ZX.01G0088100缺少11号motif,其余均完全具有分析到的13个motif。系统进化分析显示了PePAL5与双子叶植物特别是烟草、猕猴桃和大豆的进化关系比较相近,ZX.01G0111220与猕猴桃、ZX.01G0088100与麻风树、ZX.04G0029600与拟南芥、水稻以及ZX.01G0129760与大豆的进化关系比较相近。4.成功构建紫果和黄果PePAL5基因的GFP亚细胞定位载体和过表达载体。激光共聚焦观测结果表明PePAL5在黄果和紫果中均主要定位在细胞核。侵染拟南芥植株获得PePAL5P和PePAL5Y过表达的T2代转基因的拟南芥植株,该转基因植株可以抗潮霉素的筛选,DNA PCR分子验证表明转基因阳性拟南芥植株含有PePAL5基因,GUS染色则再次验证了转基因阳性植株的成功获得。定量表达结果显示,PePAL5在阳性植株中大量表达,转入PePAL5P和PePAL5Y的阳性植株分别高出野生型植株以及转入空载的植株48和27倍左右,T2代的表型跟野生型拟南芥相比营养生长更加旺盛叶片数目增多,叶片更大更长,株高更高,根系更加庞大;生殖生长方面,开花更晚,但抽薹数和开花量增多。百香果的原位转化方法为将携带pCAMBIA1301-PePAL5P/Y农杆菌的植株利用枪头倒扣法侵染去掉上胚轴的百香果实生苗,利用parafilm膜包裹保湿,黑色塑料袋的遮光处理促进愈伤组织形成新芽,再通过涂抹潮霉素进行筛选。百香果紫果和黄果原位转化植株筛选后的出芽率分别为40.42%和28.15%,DNA水平的鉴定阳性率为33.96%。阳性植株同样可以与GUS染色试剂生成不会被洗脱的蓝色物质。定量结果也验证了PePAL5基因在转基因植株中的更高表达（同比侵染水的百香果叶片）。