结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是常见的消化道恶性肿瘤之一,在全世界范围内,结直肠癌发病率高居第五位,每年约有120万的新发病例。在中国,结直肠癌的发病率显著高于世界平均水平。男性中,结直肠癌的发病率居肿瘤中第三位;女性中居第三位。随着饮食结构及生活习惯的改变,结直肠癌的发病率正在快速上升。结直肠癌患者的预后较差,约50%-60%的病人最终死于远处转移和术后复发,晚期结直肠癌的五年生存率不足5%。因此,为了给予结直肠癌患者更准确、更有效的干预,仍需对结直肠癌发生发展所涉及的分子机制和信号通路进行更深入的研究。众所周知,在真核生物中,转录调控过程十分复杂,DNA转录为RNA,RNA翻译成蛋白质,是人类基因的“中心法则”,这一系列过程往往需要多种蛋白因子的协助。ETS同源因子(ETS Homologous Factor,EHF)作为一种转录因子,为ETS(E-twenty six)转录因子超家族成员之一,编码的蛋白质作为转录阻遏物参与上皮细胞的分化和癌的发生。根据目前的研究结果显示,EHF在前列腺癌以及食管癌组织中处于低表达水平;然而在卵巢癌、乳腺癌、以及胃癌等多种癌组织中均处于高表达水平。到目前为止,EHF在结直肠癌中表达状况、生物学功能及其作用机制尚不清楚,因此,本课题组选定其作为研究对象,试图阐述其在结直肠癌发生发展进程中的作用及可能产生的分子机制。方法1、利用Real-time PCR法检测结直肠癌组织及细胞系中EHF mRNA表达水平;利用免疫组化方法及Western blot检测结直肠癌组织及细胞系中EHF蛋白的表达水平,明确EHF在结直肠癌组织中的表达水平及其与临床病理参数之间的关系。2、应用慢病毒感染的方法,构建EHF稳定沉默的结直肠癌细胞株及对照细胞株。运用CCK8实验与平板克隆实验检测细胞的体外增殖能力;利用流式细胞学分析EHF对细胞周期的改变;应用划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞体外迁移、侵袭的能力;利用裸鼠皮下成瘤实验观察EHF对结直肠癌细胞裸鼠体内成瘤能力的改变。3、构建EHF过表达质粒,运用瞬时转染技术对结直肠癌细胞株进行转染,观察过表达EHF后对结直肠癌细胞体外增殖能力、克隆形成能力、细胞周期分布、凋亡、侵袭及转移能力的影响。4、利用Qlucore Omics Explorer软件GO聚类分析、基因富集分析(GSEA)及公共数据库分析EHF可能参与的信号通路;在此基础上,通过生物信息学预测、染色质免疫共沉淀以及双荧光素酶报告基因检测系统,初步揭示EHF调控的下游靶基因以及可能参与的信号通路。结果1、检测EHF在正常以及结直肠癌细胞株和组织中的表达水平我们利用Real-time PCR技术检测了 EHF在正常肠粘膜上皮细胞株FHC和HT29、LoVo、HCT116、SW480、M5、DLD1、LS174T、SW620、RKO 等 9种结直肠癌细胞株中的表达情况,除HT29细胞株外,EHF在其他8株结直肠癌细胞中的表达水平均显著高于正常肠上皮细胞。此外,在31对正常粘膜组织以及结直肠癌配对组织中,EHF在癌组织中的表达水平同样明显高于配对的正常组织(P=0.0303)。2、结直肠癌组织中EHF的表达水平和患者临床病理参数和预后之间的关系我们利用EHF特异性免疫组织化学抗体,分析了结直肠癌组织及正常结直肠组织中EHF的表达情况,发现EHF表达定位在细胞核中,在正常结直肠粘膜上皮组织中,14.8%的组织不表达EHF,85.2%的组织中EHF呈低表达状态;而98%的结直肠癌组织中表达EHF,且大部分标本中EHF呈中高度表达状态。统计结果显示,EHF在结直肠癌组织的表达水平明显高于正常对照组织(P=0.014),并且EHF的表达水平与患者的肿瘤分化、T分期密切相关(P<0.05),而与患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、淋巴结转移(N分期)、远处转移(M分期)无明显相关性(P>0.05)。我们运用公共数据库(GSEA39586,n=585)的结果进一步分析发现:EHF高表达的结直肠癌患者其生存时间明显短于EHF低表达的患者(103.94±6.61 vs.133.35±7.20),差异具有统计学意义(P<0.001)。3、沉默EHF后降低了结直肠癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力利用慢病毒感染的方法,将含有效干扰片段及对照病毒的上清分别感染至LoVo和HCT116细胞中,经嘌呤霉素药物筛选、Real-time PCR检测及Western blot鉴定,成功构建EHF稳定沉默的结直肠癌细胞株LoVo-LUC/SH和HCT116-LUC/SH 以及对照细胞株 LoVo-LUC/NC 和 HCT116-LUC/NC。CCK8增殖实验结果显示:与对照组相比,HCT116-LUC/SH和LoVo-LUC/SH细胞的增殖能力明显下降(FHCT1116=4.94,P=0.003;FLoVo=34.939,P=0.001)。平板克隆形成实验结果显示:与对照组相比,沉默EHF表达后,结直肠癌细胞克隆形成能力显著降低(FHCT116=5.944,P=0.02;FLoVo=7.141,P=0.003)。细胞的周期分布和凋亡结果显示:沉默EHF表达后,结直肠癌细胞株HCT116和LoVo发生了G1 期阻滞(FHCT116=3.071,P=0.049;FLoVo=9.112,P=0.001),并影响 HCT116 和 LoVo 细胞的早期凋亡(FHCT116=6.004,P=0.012;FLoVo=5.304,P=0.029)。划痕实验结果显示:沉默EHF表达后,可明显抑制HCT116和LoVo细胞的迁移能力(FHCT116=15.183,P<0.001;FLoVo=12.993,P<0.001)。Transwell实验结果显示:沉默EHF表达后,结直肠癌细胞株HCT116和Lo Vo的侵袭能力显著降低(FHCT116=31.932,P<0.001;FLoVo=13.211,P<0.001)。裸鼠皮下成瘤实验结果显示:稳定沉默EHF表达后,能够抑制结直肠癌细胞在裸鼠皮下的成瘤能力(F=39.58;P<0.005)。4、过表达EHF后,促进了SW480细胞的增殖、侵袭和迁移能力构建EHF过表达载体后,将其瞬时转染至结直肠癌SW480以及HT29细胞当中,经验证后,利用过表达EHF的结直肠癌细胞进行体外功能实验。CCK8实验结果显示:过表达EHF后,SW480和HT29细胞的增殖能力明显升高(FSW480=85.419,P<0.001;FHT29=84.632,P<0.001)。平板克隆实验结果显示:过表达EHF后,SW480和HT29细胞形成克隆能力明显增多(FSW480=4.538,P=0.021;FHT29=5.614,P=0.006)。细胞周期及凋亡检测结果显示:过表达EHF后,对细胞周期并没有产生明显的影响(FSW480=0.878,P=0.444 FHT29=1.421,P=0.232),但可以影响SW480细胞的早期凋亡(F=6.062,P=0.007);而对HT29细胞的早期凋亡无明显影响(FHT29=0.557,P=0.610)。划痕及Transwell侵袭实验结果显示:过表达EHF后,SW480细胞的侵袭、迁移能力明显增强(F=6.911,P<0.001)。5、EHF可能参与结直肠癌发生发展的作用机制5.1 EHF可能参与的信号途径利用Qlucore Omics Explorer软件与公共数据库,在同一个数据库当中分析EHF表达有差异的基因,我们发现有200个基因上调,196个基因下调;并利用这些差异基因进行GO聚类分析,获得这些基因可能参与的信号通路。同时,利用基因富集分析(GSEA)软件分析EHF在结直肠癌组织对中进行富集分析。综合以上分析结果,我们发现,与EHF协同作用的基因主要涉及正向调控干细胞进程、血管生成、细胞分化及细胞增殖等方面;而与EHF基因拮抗作用的基因,主要在核酸代谢、蛋白修饰、负向调控基因表达等方面起作用。根据软件分析结果以及文献阅读发现,EHF主要参与TGF-β通路、MAPK通路、Notch等信号通路的调节。5.2 EHF与TGF-β信号通路的关系在干扰或过表达EHF的细胞株中检测TGF-β信号通路关键分子的表达,发现干扰EHF后TGF表达水平明显下调(FSW480=11.173,P<0.001),过表达EHF后TGF-β呈明显上调趋势,表明EHF可参与TGF-β信号通路的调控(FHCT116=8.744,P=0.001)。5.3 EHF对TGF-β的转录调控效应利用JASPAR软件预测分析发现,TGF-β启动子区含有2个EHF的结合位点。染色质免疫共沉淀实验证实EHF可以与TGF-β基因的启动子序列结合。以人基因组DNA为模板,PCR方法扩增TGF-β启动子片段并定向克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-basic,构建含TGF-β启动子片段的荧光素酶报告基因载体pGL3-TGF-β。经分析发现,在293T细胞中,pGL3-TGF-β载体的转录活性是 pGL3-basic 的 2.73 倍(F=11.216,P=0.005),说明 pGL3-TGF-β 具有启动子活性。而加入EHF过表达质粒后,能够明显增加pGL3-TGF-β的启动子活性,说明EHF对TGF-β具有转录激活作用,是pGL3-TGF-β组的2.01倍(F=4.503,P=0.037)。5.4 TGF-β对EHF的转录调控效应利用TGF-β刺激剂/抑制剂处理SW480和HCT116细胞36h后,利用Real-time PCR检测EHF的表达情况,结果显示,在给予TGF-β刺激剂处理以后,EHF的表达明显比对照组升高(FSW480=4.142,P=0.014;FHCT116=10.582,P=0.006)。在给予TGF-β抑制剂处理以后,EHF的表达明显比对照组下降(FSW480=3.992,P=0.034;FHCT116=5.961,P=0.004),说明TGF-β对EHF也具有调控效应。结论1、在结直肠癌细胞株及癌组织中EHF呈高表达水平,其表达水平的高低与结直肠癌的侵袭、转移和不良预后密切相关;并有望成为结直肠癌早期诊断以及影响预后的判断标志物。2、EHF高表达能够促进结直肠癌细胞在体内、外的增殖、迁移、侵袭和转移能力。3、EHF与TGF-β形成正反馈环路,激活TGF-β信号通路促进结直肠癌的发生发展。