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低温诱导的血管内皮细胞损伤是导致冻疮等肢端病症的主要因素,而血管芯片作为一种体外血管模型,可将血管内皮细胞培养在微流控通道内,并施加灌流剪切力模拟血液流动,常被用于血管的生理与病理研究。但现有血管芯片的通道缺乏温度响应性,无法模拟肢端微血管收缩的冷应激过程,从而难以准确解析低温对血管内皮细胞的损伤机制。因此,本文首先在芯片的基底材料聚二甲基硅氧烷(PDMS)表面制备了细胞相容性良好的温敏水凝胶涂层,并构建仿生肢端微血管的双通道血管芯片;随后,利用该芯片考察了低温对血管内皮细胞功能表达的影响,并进一步将其用于低温加剧高糖致血管损伤的研究。首先,以猪皮明胶(Gel)为原料制备了甲基丙烯酰化明胶(Gel-MA),将其与N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)以质量比1:1共混为不同浓度的单体溶液。通过对二苯甲酮(BP)处理时长和紫外(UV)引发时长的优化,得到其在PDMS上的最佳接枝条件为单体浓度15%,BP处理时长20 min,紫外引发时长20 min,此时水凝胶涂层厚度为80 μm,均匀性最佳。随后对该水凝胶涂层进行各项理化表征。结构形态方面,通过红外光谱(FTIR)确定了两种单体的成功接枝;并通过扫描电子显微镜(SEM)与能谱仪(EDS)观察了涂层形态与氮元素分布。温敏性能方面,该涂层低临界溶解温度(LCST)为31℃;涂层溶胀率为18.5%,退溶胀率15.9%。力学性能方面,涂层对PDMS基底的机械强度无显著影响,且该涂层具有优异的抗压、抗摩擦性能,能承受高压蒸汽灭菌。细胞相容性方面,人脐静脉内皮细胞(HUVEC)可在该温敏涂层上正常黏附和增殖,且低温下细胞仍能良好黏附,这为血管芯片的应用提供了重要基础。其次,利用该温敏水凝胶涂层,构建了与肢端微血管袢形似的单通道血管芯片。在此基础上,进一步仿生化构建了双通道血管芯片,模拟人体冷应激下肢端血管内的血流再分配过程。该芯片具有较高的构建精度和良好的封接效果,并且能在20 s内完成生理温度和低温间循环相变。通过冷模试验,得出涂层厚度200μm时,目标通道在37℃和4℃间平均流速相差4%;涂层厚度300μm时,目标通道在37℃和4℃间平均流速相差10%;而涂层厚度达到700μm时,目标通道会完全堵塞。其中涂层厚度300μm时的流动特性更接近人体肢端血管受冷刺激后的血流分配变化。进一步利用该芯片探究了低温对HUVEC功能的影响,发现该模型上乳酸脱氢酶(LDH)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、内皮素-1(ET-1)和一氧化氮(NO)等内皮细胞功能表达趋势与体内一致,而静态培养下细胞功能表达不佳。最后,利用双通道温敏血管芯片探究了低温暴露对HUVEC高糖损伤的加剧作用。结果显示,高糖+低温组的血管屏障完整性最差;同时,低温会加速高糖诱导的细胞凋亡,并造成细胞坏死;此外,低温还会进一步抑制胞间钙黏蛋白的表达,引起肌动蛋白大量解聚,细胞形态无法维持;细胞功能方面,低温协同高糖促进了细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF),同时增强了 ET-1和ICAM-1的表达,并抑制NO表达;低温还加剧了活性氧自由基(ROS)堆积,导致线粒体膜电位(MMP)崩溃。上述结果在细胞水平上再现了高血糖患者更容易受到低温损伤的临床现象,并初步阐释了其发生和发展过程。而静态实验组(二维细胞板培养)并未显示低温加剧高糖损伤的作用。综上所述,与静态培养相比,仿生化双通道血管芯片更准确地反映了体内高糖与低温刺激对血管内皮细胞的损伤机制。该芯片有望用于低温暴露致心脑血管疾病的发病机理研究和治疗药物筛选,为该领域提供一种新型体外研究工具。