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细胞代谢过程中大约有20多种酶促反应需要相关的叶酸辅酶参与,比如嘌呤核苷、嘧啶核苷以及多种重要氨基酸的生物合成。因此叶酸拮抗剂甲氨蝶呤(MTX)、培美曲塞(PMX)、普拉曲沙(PDX)等在肿瘤、微生物感染和自身免疫性疾病的治疗方面占有举足轻重的地位。MTX于1949年首次合成得到,可单独或与其他化疗药物联合使用治疗乳腺癌、骨原性肉瘤和急性淋巴细胞性白血病。PDX于上世纪90年代中期问世,2009年被批准用于复发或难治性T-细胞淋巴瘤的治疗。由于肿瘤细胞分裂旺盛,为保证叶酸的供给其细胞表面还原叶酸转运蛋白-α(RFC-α)的表达量比正常细胞多。PDX通过RFC-α转运至细胞内,因而对肿瘤细胞具有一定的选择性。二氢叶酸还原酶(DHFR)是将二氢叶酸还原为四氢叶酸的辅酶,MTX和PDX都是DHFR的抑制剂。该类化合物蝶啶环上两个氨基发生质子化后与DHFR的活性位点之间形成离子键,增强了药物与DHFR的亲和性。PMX最早是作为胸腺嘧啶合成酶(TS)抑制剂研发的,用6-5稠合的吡咯并嘧啶环代替了传统6-6稠合的蝶啶环或喹啉环。随后的研究发现PMX不仅是TS的抑制剂,同时也可抑制DHFR以及嘌呤核苷从头合成过程中的甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶(GARFTase)和5-氨基咪唑-4-甲酰胺氨核糖核苷酸甲酰基转移酶(AICARFTase)的活性。目前,FDA批准PMX与顺铂联合使用治疗非小细胞肺癌和恶性胸膜间皮瘤。许多肿瘤细胞对嘌呤从头合成途径和补救途径的依赖性很大,然而正常细胞却可以只依靠补救途径存活,因此作用于嘌呤从头合成途径的药物对于肿瘤细胞具有选择性。研究发现嘌呤从头合成途径中的GARFTase和AICARFTase是理想的作用靶点。洛美曲索(LMTX)于1985年研制成功,是第一个进入临床试验的GARFTase抑制剂,它对TS和DHFR的抑制活性较弱,但对GARFTase的抑制活性却很高(Ki=6nM)同时也容易发生多聚谷氨酸化。在临床Ⅰ期试验中使用LMTX的病人出现严重的骨髓抑制和黏膜炎,这种延迟累积毒性可能是由于LMTX可同时被RFC和FR转运而缺乏对正常细胞选择性所致。目前大多数叶酸类拮抗剂的作用靶点单一,肿瘤细胞易对其产生耐药性,因此设计合成双靶点或多靶点叶酸拮抗剂是研发新型抗肿瘤药物的重要方向。本课题设计并合成了一系列2-氨基-4-氧-6-取代吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物,经体外抗肿瘤活性测试、作用机制及分子模拟研究,所合成的目标化合物可作为多靶点叶酸拮抗剂以及潜在抗肿瘤药物。目的:建立2-氨基-4-氧-6-取代吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物的合成方法,完成目标化合物的合成,优化反应条件,并对目标化合物进行体外抗肿瘤生物活性测试、作用机制及分子模拟研究。方法:以4-氯乙酰乙酸乙酯(11)为原料与2,6-二氨基-4-氧嘧啶合环得2-(2-氨基-4-氧-3,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶)乙酸乙酯(13)。中间体13经三乙基硼氢化锂(LiBHEt3)还原得2-氨基-6-(2-羟乙基)-3,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-酮(14)。中间体14以甲基磺酰氯为磺酰化试剂,制得关键中间体(2-氨基-4-氧-3,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)乙基甲磺酸酯(15)。中间体15在氢化钠的作用下与巯基乙酸甲酯或者巯基丙酸甲酯发生亲核取代反应,经水解酸化后得2-(2-(2-氨基-4-氧-4,7-二氢-3H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)乙基硫醚)乙酸(17a)和2-(2-(2-氨基-4-氧-4,7-二氢-3H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)乙基硫醚)丙酸(17b)。以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三唑(HOBt)作为缩合剂,中间体17a或17b与不同的氨甲基吡啶缩合得到目标化合物1-6。中间体17a或17b在N-甲基吗啉(NMM)和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)的催化下与L-谷氨酸二乙酯盐酸盐缩合,经过水解并酸化后得到目标化合物7-8。中间体14分别与对羟基苯甲酸乙酯或对巯基苯甲酸甲酯发生亲核取代反应,经水解酸化后与L-谷氨酸二乙酯盐酸盐缩合,再经水解酸化得到目标化合物9-10。通过熔点、高分辨质谱、核磁共振氢谱和碳谱等方法对各重要中间体和目标化合物进行结构确证。选用口腔表皮样癌细胞(KB)、结肠癌细胞(SW620)和非小细胞肺癌细胞(A549)为实验对象,并以经典叶酸拮抗剂MTX和PMX作为阳性对照药,对目标化合物1-8的体外抗肿瘤活性进行测试,同时开展核苷酸保护实验以确定目标化合物的分子内作用靶点。运用MOE(2009.10)分子模拟软件对化合物进行分子对接实验,进一步阐释目标化合物的作用机制。结果:按照所设计的合成路线成功合成目标化合物1-10,通过HRMS、1H-NMR和13C-NMR对重要中间体及目标化合物进行了结构确证,并对合成路线进行了优化。完成化合物1-8的体外抗肿瘤活性测试、作用机制及分子模拟研究。结论:所合成的目标化合物具有良好的抗肿瘤活性,其中化合物8抑制A549细胞增殖的活性优于阳性对照药MTX和PMX。分子作用机制研究表明,化合物8是TS和AICARFTase的双重抑制剂,诱导SW620细胞在S-期聚集并引发细胞凋亡。分子模拟结果与生物活性研究结果一致,从而验证了该类化合物的设计思想。