牡蛎铁蛋白理化特性分析与亚基的克隆表达

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铁蛋白是一种广泛存在于生物体中的含铁蛋白,它具有储存和释放铁的生理功能。目前,国内外许多铁蛋白研究机构已陆续报道了有关高等动物铁蛋白的理化特性和亚基克隆表达等研究工作,但在贝类研究领域中,有关铁蛋白的结构与功能研究方面的报道并不多,尤其是牡蛎。本文从牡蛎内脏团中制备高纯度的铁蛋白,采用SDS-PAGE技术研究牡蛎铁蛋白的亚基类型,发现牡蛎铁蛋白由单类型亚基组成,亚基分子量约为20 kDa,并用肽质量指纹图谱技术进一步验证了所制备蛋白是牡蛎铁蛋白。透射电子显微镜观测牡蛎铁蛋白的分子结构由蛋白壳和铁核组成,其中高电子密度的铁核(黑色球状体)位于蛋白壳(白色球空腔)的中心区域。选用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术直接分析牡蛎铁蛋白亚基类型,进一步确认该铁蛋白确实由单类型亚基组成,分子量为19871.042 Da,认为这一特性不同于由H和L亚基类型组成的哺乳动物铁蛋白。释放铁动力学研究表明,牡蛎铁蛋白含铁量相对较低,每分子铁蛋白仅含有166个铁原子,明显低于哺乳动物铁蛋白,但铁释放规律和趋势却与哺乳动物铁蛋白很相似,即在反应时间43 min时出现释放铁的速率拐点,并可区分为两个不同释放铁的阶段,但均符合一级动力学反应规律。   为了揭示牡蛎铁蛋白结构与功能且能适用于环境监测和生物医药,本文克隆、表达、纯化和制备了牡蛎铁蛋白亚基,并分析了该亚基的一级、二级和三级结构,探讨了铁蛋白亚基络合顺铂能力、数量和稳定性。ICP-MS技术研究发现,每个牡蛎铁蛋白亚基可以络合22.9个顺铂分子,构成了铁蛋白亚基-顺铂复合物,这为后续研制铁蛋白抗肿瘤药物且适合于临床用药,并具有减少顺铂耐药性等特色新药提供重要的科学依据。此外,还发现了牡蛎在不同浓度镉盐胁迫下,其铁蛋白mRNA表达量与金属镉量呈线性递增趋势,并选用Western blotting方法进一步佐证这一实验结果,提高实验结果的可信度,可为拓展牡蛎铁蛋白mRNA表达量作为监控海洋金属镉污染程度及危害性的新颖核酸标志物。进一步研究还发现了,牡蛎在弧菌感染的条件下,牡蛎铁蛋白mRNA的表达量也明显上调,认为牡蛎提高铁蛋白表达量的作用之一是起到抗菌效益,这一核酸标志物也可用于选育高抗菌牡蛎品种,为减少养殖风险和提高养殖产量起着重要的作用,潜在着应用价值,预期能产生较高的经济和社会效益。
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