减数分裂是男性精原细胞向精子分化的重要过程,它的正常发生和完成很大程度上依赖于减数分裂前期I的同源染色体联会、交换和分离,与遗传重组密切相关。研究已经证实精母细胞减数分裂前期I发生异常,会使减数分裂发生紊乱、停滞,甚至导致无精。因此,对减数分裂遗传重组频率和联会的分析将有助于理解精子发生障碍的机制,从而揭示男性不育的病因。随着肿瘤治疗技术的快速发展,男性肿瘤患者存活率不断提高的同时,其对生育力保存的需求也不断增加。因此,如何安全保存男性肿瘤患者的生育力,使之将来获得健康子代备受关注,也是目前生殖医学和肿瘤学面临的共同难题。为了达到延长患者生命与生育力保存相平衡的最终目标,临床医生在制定抗肿瘤治疗方案时,首先要考虑抗肿瘤药物对男性生殖细胞的药物毒性及安全性。在众多抗肿瘤药物中具有代表性的两种药物有:传统抗肿瘤药物曲古霉素A(Trichostation A,TSA)及新型抗肿瘤药物GSK2126458。目前这两种药物已开始用于抗肿瘤治疗的临床研究,但是其对男性生精细胞是否有影响?国内外尚未见报道。睾丸组织冷冻已经成为男性生育力保存的另一重要手段。但是睾丸组织冷冻技术本身也仍然存在许多问题,如:睾丸组织冷冻方法(有程序化慢速冷冻和快速冷冻等)尚没有统一标准;冷冻保护剂的选择也尚存争议。目前关于不同冷冻方法对人睾丸组织精母细胞减数分裂的影响,仅有少数关于程序化慢速冷冻的报道,而对于应用最多的快速冷冻法是否有影响?国内外尚未见文献报道。因此,深入研究抗肿瘤药物和快速冷冻法对精母细胞遗传重组的影响,不仅能评估其安全性,也为男性肿瘤患者进行生育力保存选择最佳时机和冷冻方法提供依据。目的:本研究采用免疫荧光法,对比不同浓度抗肿瘤药物TSA和GSK2126458对雄性小鼠生精功能、精母细胞减数分裂遗传重组位点及联会保真度的影响;对比快速冷冻前后人睾丸组织精母细胞减数分裂遗传重组及不同来源人睾丸组织中MLH1基因的表达差异。旨在评估两种抗肿瘤药物及快速冷冻法的安全性,为临床应用提供依据。方法:1.抗肿瘤药物TSA和GSK2126458对雄性小鼠生精功能的影响。将18只小鼠随机分为:TSA(0.1)组(3只);TSA(0.2)组(3只);GSK(0.1)组(3只);GSK(0.2)组(3只);对照组(6只)。各组一部分睾丸组织采用铺展法制片和免疫荧光法进行同源染色体遗传重组和联会的保真度分析;另一部分组织切片制备及HE染色。各组获取附睾液中的精子进行密度及活率等观察。2.快速冷冻对人精母细胞减数分裂遗传重组的影响。将4例前列腺癌患者的睾丸组织随机分为两部分:一部分新鲜铺片,另一部分快速冷冻。采用快速冷冻与未冷冻的睾丸组织采用铺展法制片和免疫荧光法进行同源染色体遗传重组和联会的保真度分析。3.不同来源睾丸组织中MLH1基因的表达。分为梗阻性无精症组(n=8),非梗阻性无精症组(n=14)和正常生精组(n=12)。采用定量RT-PCR分析各组MLH1基因的表达。结果:1.TSA(0.1)组的每个细胞上MLH1的数目明显高于对照组(P<0.05),与TSA(0.2)组比较无统计学差异(P>0.05)。两TSA组MLH1数目为0的SC平均数目均低于对照组(P<0.05,P<0.05)、MLH1数目为1的SC平均数目均高于对照组(P<0.05,P<0.05)。TSA(0.1)组小鼠左侧睾丸重量明显低于对照组(P<0.05)。2.两GSK组中MLH1的数目、MLH1数目为0-3的SC平均数目、XY染色体上含有MLH1位点的细胞比例、含gaps、splits的细胞比例及小鼠体重、睾丸重量、精子密度、精子活力及精子活率比较,均无统计学差异(P>0.05)。3.两TSA组每个细胞上MLH1的数目明显高于两GSK组(P<0.01,P<0.05)。TSA(0.1)组MLH1数目为0的SC平均数目均明显低于其它三组(均P<0.05),MLH1数目为1的SC平均数目均明显高于其它三组(均P<0.05)。4.同一病例新鲜与冻融后人睾丸组织减数分裂的重组频率和联会保真度都没有差异(P>0.05)。5.两无精症组中MLH1的表达显著高于均正常生精组(P<0.05);而且非梗阻性无精症组中MLH1的表达显著高于梗阻性无精症组(P<0.05)。结论:1.两浓度TSA均增加雄性小鼠精母细胞减数分裂遗传重组频率。2.两浓度GSK2126458对雄性小鼠精母细胞减数分裂遗传重组频率、联会及生精功能均无明显影响。3.TSA对雄性小鼠精母细胞减数分裂遗传重组频率的影响大于GSK2126458,建议临床上男性抗肿瘤药物治疗优先选择GSK2126458。4.快速冷冻不影响人睾丸组织精母细胞减数分裂遗传重组频率及联会保真度,是男性生育力保存的有效方法。5.无精症患者MLH1基因高表达,可能与MLH1基因介导调控人类睾丸精子发生有关。