细胞自噬作为一种进化上保守的蛋白质降解途径,对维持细胞稳态、细胞生存等都起着关键性的作用。近年来亮氨酸可以作为信号分子调控细胞自噬受到广泛关注,蛋白质翻译后修饰作为一种重要调控方式,参与了几乎所有生物学过程的调控。然而,目前对于翻译后修饰是如何调控亮氨酸缺失激活自噬过程的还知之甚少。本研究首先验证了亮氨酸缺失与细胞自噬的关系。亮氨酸缺失2小时后,自噬Maker蛋白LC-Ⅱ型相对丰度达到最大。AML12细胞转染GFP-LC3质粒后,亮氨酸缺失2h与对照组细胞相比,点状GFP-LC3数目显著增加,在稳定转染GFP-LC3的HeLa细胞中观察到同样的现象。以上结果都表明亮氨酸缺失会激活细胞自噬。通过Western blot实验筛选受亮氨酸调控的翻译后修饰,发现AML12细胞乙酰化、泛素化、琥珀酰化修饰水平在亮氨酸缺失处理后变化不明显,只有部分条带出现差异,而亮氨酸缺失处理后巴豆酰化修饰水平在明显上调。激光共聚焦显微镜(Confocal)实验也证明,亮氨酸缺失会显著上调巴豆酰化修饰水平。以上结果证明,亮氨酸缺失的情况下能激活细胞自噬,同时提高巴豆酰化修饰水平。此外,巴豆酸钠(NaCr)处理提高巴豆酰化修饰的同时,能激活AML12以及HeLa细胞自噬,进一步表明巴豆酰化修饰与细胞自噬存在一定的正相关性。为了进一步鉴定AML12细胞中受亮氨酸调控的蛋白以及巴豆酰化位点,我们进行了基于TMT标记技术的蛋白质组学和巴豆酰化蛋白组学的研究。样品分为正常组与亮氨酸缺失组,每组三个重复。蛋白质组学在AML12中共鉴定到5644个蛋白,其中可定量蛋白数为5026个。巴豆酰化组学在6个AML12细胞样品中,一共在654个蛋白上鉴定到1898个巴豆酰化修饰位点,其中536个蛋白上1501个位点可以被定量到。亮氨酸缺失处理后巴豆酰化高修饰丰度位点显著增加,低修饰丰度位点显著减少。氨基酸基序(Motif)分析发现,赖氨酸修饰位点±1位显著富集到天冬氨酸与谷氨酸两种酸性氨基酸。利用全蛋白质组学数据对巴豆酰化蛋白质组学数据进行归一化处理,以差异倍数>1.5或<0.67且p值<0.05为筛选条件,发现208个蛋白上326个巴豆酰化位点出现显著差异,其中189个蛋白上298个位点显著上调,19个蛋白上28个位点显著下调。对差异巴豆酰化蛋白进行功能富集分析发现,差异蛋白主要分布在细胞质(50%)、细胞核(31%)、以及线粒体(6%)上,参与一系列信号通路,如PI3K-AKT通路等,差异巴豆酰化位点富集到的蛋白结构域包括14-3-3结构域、Ⅱ型氨酰tRNA合成酶、泛素相关结构域等。结合通路富集分析以及结构域富集分析,发现14-3-3家族蛋白可能是关键候选巴豆酰化蛋白,其中14-3-3?上K73以及K78位点修饰水平变化最为明显。进一步IP实验验证了14-3-3?在亮氨酸缺失后,巴豆酰化水平确实发生了上调。综上所述,(1)本研究证明了亮氨酸缺失激活细胞自噬;(2)亮氨酸缺失对乙酰化、泛素化、琥珀酰化修饰无明显影响,而能显著提高巴豆酰化修饰水平;(3)证明了巴豆酸钠作为一种巴豆酰化修饰的激活剂,可以激活细胞自噬;(4)通过巴豆酰化蛋白质组学研究,鉴定到了一系列受亮氨酸调控的蛋白和巴豆酰化位点;(5)14-3-3?上K73和K78巴豆酰化位点可能是参与调控亮氨酸缺失诱导自噬过程中的关键候选巴豆酰化位点。