论文部分内容阅读
花绒寄甲(Dastarcus helophoroides)是多种林木害虫,尤其是天牛类害虫的重要天敌。利用花绒寄甲对天牛进行生物防治,具有安全、高效且持续性强的特点,且在适宜的饲养条件下,花绒寄甲的寿命较长,而且能持续进行有性繁殖,其特殊性为研究昆虫繁殖的生理与分子机制提供了宝贵的资源。为探索花绒寄甲生长发育的分子机制,本研究利用高通量测序平台Illumina novaseq TM6000分别对4龄幼虫(L1)、6龄幼虫(L2)、蛹(L3)、一年成虫(L4)、两年成虫(L5)和四年成虫(L6)等6个不同发育阶段的花绒寄甲进行了转录组测序分析,揭示其生长发育相关基因在不同发育阶段的表达信息。主要结论如下:(1)通过对花绒寄甲18个样品(6个不同发育阶段,每个3次重复)进行转录组测序,各样品获得的原始序列(Raw Reads)数目在16155301个~20624868个范围内,经过质控后获得的Clean reads数目在15599491个~20179992个之间,过滤后的Clean reads数量占Raw Reads的比例平均值为97.79%。通过HISAT软件将各样品的Clean reads与花绒寄甲的参考基因组进行比对分析,比对结果在77.88%~90.38%之间,均大于70%,证明了本试验结果的可靠性。(2)本研究对花绒寄甲18个文库中所有基因的FPKM值进行了分布统计,并采用DESeq软件对花绒寄甲18个转录组文库数据进行两两比较(一共15个比较组(Group)),从而筛选出差异表达基因,筛选标准为FDR<0.05。各Group差异表达基因筛选结果为:4380个(L1 VS L3)、1825个(L2 VS L1)、2916个(L2 VS L3)、2909个(L4 VS L1)、2516个(L4 VS L2)、2547个(L4 VS L3)、5565个(L5 VS L1)、5187个(L5 VS L2)、5621个(L5 VS L3)、1620个(L5 VS L4)、5015个(L6 VS L1)、4839个(L6 VS L2)、5277个(L6 VS L3)、1221个(L6 VS L4)、30个(L6 VS L5)。其中二年成虫和四年成虫之间,差异表达基因的数目最少,蛹期与两年成虫之间差异表达基因的数目最多。差异表达基因数目越多,说明其基因表达模式差别越大。(3)从15个两两比较组中选择10个具有代表性的Group,对其差异表达基因进行GO功能注释,注释结果分为三类:生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。每个Group中注释到的显著性富集的条目数量为118个(L1 VS L3)、35个(L2 VS L3)、95个(L4 VS L3)、136个(L5 VS L3)、137个(L6 VS L3)、66个(L4 VS L1)、122个(L5 VS L1)、98个(L6 VS L1)、45个(L6 VS L4)、0个(L6 VS L5)。对于每个Group而言,注释到生物学过程(BP)、细胞组分(CC)及分子功能(MF)上的条目及其数量都有区别。总体上注释到三个类别上的基因数目:生物学过程(BP)>分子功能(MF)>细胞组分(CC)。(4)对上述10个Group的差异表达基因进行KEGG代谢通路分析,每个Group中富集到的通路数目为:109个(L1 VS L3)、107个(L2 VS L3)、103个(L4 VS L3)、107个(L5 VS L3)、106个(L6 VS L3)、110个(L4 VS L1)、112个(L5VS L1)、111个(L6 VS L1)、79个(L6 VS L4)、7个(L6 VS L5)。在不同的Group中分别发现了几种对花绒寄甲生长发育起重要作用的代谢及信号转导通路:各类氨基酸、脂肪酸、核苷酸、核黄素等代谢途径以及TGF-β信号通路等,每一种通路在不同的发育阶段都参与了花绒寄甲的生长发育过程,为后续从分子方向分析花绒寄甲的全生命周期提供了基础。(5)从花绒寄甲转录组数据库中筛选出与花绒寄甲生长发育相关的保幼激素(JH)、蜕皮激素(Ecd)、生长因子(GF)、G蛋白(GP)和核受体(NR)等五类共29个差异表达基因,通过RT-qPCR检测其在花绒寄甲不同发育阶段样品中的表达,结果显示,绝大多数候选基因的qPCR结果与RNA-seq结果的变化趋势一致,其中JH-5、Ecd-4、Ecd-5、GF-1、GF-2、GP-2、NR-2等多数基因差异表达明显,且部分基因几乎在蛹期呈现特异性高表达。本研究通过对不同发育阶段的花绒寄甲进行转录组测序,筛选出各比较组中的差异表达基因,并对其进行了GO、KEGG富集分析,探索出与花绒寄甲生长发育相关的关键基因及各类通路等,并利用RT-qPCR技术揭示了相关候选基因在不同发育阶段的表达特性,为揭示花绒寄甲的生长发育机制提供了理论基础。