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细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有生物活性的多肽或蛋白质类物质,因具有不易使肠道病原细菌产生耐药性且无致畸变、无毒性蓄积作用,被认为是具有巨大商业潜力的优良生物防腐剂。细菌素对李斯特菌、葡萄球菌等多种肠道病原细菌具有抑制作用。因此不断发现新的细菌素可为开发新型药物提供参考,必将极大推动该领域的研究开发和应用。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuriniensis,简称Bt)是一种应用广泛的微生物杀虫剂。除了含有杀虫晶体蛋白外,它还能产生一类大小不同的具有抑菌或杀菌作用的细菌素(Bacteriacin),亦称为“苏云金菌素(thuricin)”。本研究采用改良的“琼脂打孔药剂扩散法”(agar-well diffusion method)从94株野生菌株中筛选出15株对李斯特菌有抗性的Bt菌,并且选取抗菌活性较高的BRC-ZLL5和BRC-XQ6进一步研究,对应的病原菌指示菌分别是单核增生李斯特菌(Listeria monocytohenes,简称Lm)100625 和 100626。本研究验证了 BRC-ZLL5 和 BRC-XQ6对4种益生菌没有抗菌活性,因此进一步开展了 BRC-ZLL5和BRC-XQ6对其余40株肠道病原细菌和对7株Bt标准菌株及自身的抗性筛选。结果表明,BRC-ZLL5分别对李斯特菌、铜绿假单胞杆菌、粪链球菌具有不同程度的抗性,而BRC-XQ6对李斯特菌和表皮葡萄球菌有抗性。目前国内外已分离出的Bt细菌素大多数对Lm、蜡样芽胞杆菌有明显效果,部分细菌素对粪链球菌、葡萄球菌、化脓性链球菌、致病性绿脓假单胞杆菌、霍乱弧菌、梭状肉毒杆菌有抗性,但未报道对铜绿假单胞杆菌有抗性的细菌素。研究结果还表明,这2株菌株均对7株Bt标准菌株及自身无抑菌活性,推测这些Bt菌株中含有针对BRC-ZLL5和BRC-XQ6细菌素的免疫因子。本研究对BRC-ZLL5和BRC-XQ6细菌素进行了 72 h的活性动态监测实验。结果表明BRC-ZLL5的抗菌活性的分布时间比较集中(6-18 h),其中当菌株培养至12 h时,抗菌活性达到最大值。BRC-XQ6的抗菌活性分布在菌株生长的各个时期,在56 h时活性达到最大。大多数已报道的Bt细菌素在菌液培养至30h时活性达到最大。经饱和硫酸铵分级沉降法和Tricine-SDS-PAGE分析,分别选用70%和50%的饱和硫酸铵浓度部分纯化BRC-ZLL5和BRC-XQ6细菌素。一般Bt细菌素分子量大小在1-14.5 kDa,为多肽或蛋白类。一般将分子量小于10 kDa的细菌素认定为多肽,分子量大于或等于10 kDa的细菌素认定为蛋白质。大多数细菌素耐pH(pH1-11)和耐热(80-120℃)范围较大,经蛋白酶K和胰凝乳蛋白酶处理丧失活性,杀菌和溶菌是最常见的作用模式,少数会出现抑菌。本研究经凝胶原位活性检测初步判断BRC-ZLL5和BRC-XQ6细菌素分子量大小分别在10 kDa和20 kDa左右。本研究还表明BRC-ZLL5的抗菌作用方式是抑菌,具有较广的pH耐受范围(pH3-9)和耐热能力(120℃处理仍具有活性),对蛋白酶K和胰凝乳蛋白酶敏感。根据细菌素的分类,初步推断BRC-ZLL5细菌素是一类蛋白物质,属于第一类或者第二类细菌素。一般将分子量在10-30 kDa之间的定义为细菌素类似物。研究表明BRC-XQ6细菌素的抗菌作用方式是杀菌和溶菌,是一类对pH(pH3-9)和温度(经80℃处理失去活性)较敏感的细菌素类似物。大多数芽胞杆菌的多种毒力因子会受到多效性调控子(pleiotropic regulator)plcR的调控,在其条件致病性作用中起着重要作用。本研究表明突变株Bt407ΔplcR比Bt 407具有更广的抑菌谱,且抗菌活性提高1.3-2.7倍。胞内外分泌试验表明了 Bt 407和Bt 407ΔplcR细菌素的分泌都集中在发酵上清液,不存在于细胞质中,是属于完全胞外分泌。本研究根据已知的BtplcR基因上下游序列,克隆了 BRC-ZLL5和BRC-XQ6plcR基因上下游共4 kb的序列,经比对其同源性分别达97%和95%,为研究plcR对细菌素的调控机制奠定了基础。