新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）感染可导致禽类严重的疾病。NDV的融合蛋白（F）裂解位点（F cleavage site,Fcs）是其主要的毒力因子。中、强毒株Fcs含有多个碱性氨基酸,共有基序为“¹¹²R/K-R-Q/R/K-R/K-R↓F¹¹⁷”,可诱导细胞膜融合形成合胞体进而导致细胞病变（CPE）并引起疾病。弱毒株Fcs仅有1个或2个碱性氨基酸,共有基序为“¹¹²G/E-K/R-Q-G/E-R↓L¹¹⁷”,不能诱导膜融合及CPE,不具有致病性。本实验室前期针对强毒Fcs（Virulent Fcs,VFcs）的不同碱性氨基酸研究表明不同碱性氨基酸及所处基序中的位置在引起体外细胞膜融合及CPE的能力方面起关键作用,另外发现F蛋白的第二个七肽重复序列（Heptad repeat region 2,HR2）内的特定氨基酸位点对诱导体外细胞膜融合能力具有一定的影响。但是,这些重要的位点对病毒特性及毒力的影响未知。本研究旨在利用反向遗传学技术以弱毒株La Sota为骨架,拯救VFcs及HR2区域特定位点突变的重组病毒并探究以上特定位点氨基酸对病毒生物学特性的作用和致病性变化,为深入了解NDV F蛋白的功能作用提供基础理论依据。具体研究结果如下:1.重组质粒的构建及病毒拯救以La Sota疫苗株为骨架,对其Fcs“¹¹²GRQGR↓L¹¹⁷”进行突变,构建多个VFcs和HR2区域特定位点突变重组质粒,利用反向遗传学技术成功拯救出9个重组病毒其中VFcs突变5个(3K:“¹¹²RRKRR↓F¹¹⁷”;23K:“¹¹²RRKKR↓F¹¹⁷”;25K:“¹¹²KRRKR↓F¹¹⁷”;235K:“¹¹²KRKKR↓F¹¹⁷”;P₁’L:“RRQRR↓L”;命名时将117位简称为p1’,112-116位依次反向命名为p1-p5),HR2区域位点突变4个（N479D;R486S;S497G;N479D+R486S）。2.重组病毒的生物学特性VFcs突变重组病毒能够在BHK-21细胞内正常增殖并引起明显的细胞膜融合现象,同时能形成显著的蚀斑,表明VFcs的突变增强膜融合与致细胞病变能力。与La Sota相比,HR2区域特定位点突变的重组病毒生物学特性则没有显著变化。MDT和ICPI试验表明,VFcs突变重组病毒毒力均明显增强,r-23K、r-25K、r-235K的毒力可达中强毒标准,r-3K、r-P₁’L毒力介于弱毒与中强毒之间,表明碱性氨基酸赖氨酸数量为2或3个时,NDV毒力明显增强;HR2特定位点突变重组病毒的毒力符合弱毒株标准。3.重组病毒的致病性7日龄雏鸡感染VFcs突变重组病毒后患病鸡表现不同程度的食欲减退、精神萎靡沉郁、粪便下痢、倒地不起等临床症状,部分鸡还表现出不同程度的瘫痪、角弓反张等神经症状,其中以r-25K症状最为明显。与La Sota相比,r-3K、r-23K、r-25K、r-235K组的雏鸡死亡率均有所增加,其中r-25K死亡率高达90%,表明赖氨酸数量为2或3个时,NDV对雏鸡致病性明显增强。采取感染VFcs重组病毒的13种组织器官测定病毒滴度,结果显示r-23K、r-235K低于r-3K、r-25K,其中r-25K的病毒载量最高。4.重组病毒对鸡脑渗透性影响的研究对感染了VFcs重组病毒的濒死雏鸡进行颈静脉注射荧光素钠（Fluorescein sodium,Na F）,测定脑组织的Na F含量。结果显示,r-235K的大、小脑和r-3K小脑中含有较少量的Na F,r-25K组的Na F含量最高,而La Sota与r-23K组未检测到Na F。表明r-3K、r-25K、r-235K具有增加鸡脑渗透性的能力,其中r-25K作用最强。综上所述,本研究以La Sota疫苗株为骨架,利用基因定点突变构建并利用反向遗传学技术成功拯救了VFcs和HR2特定位点突变重组病毒。通过对重组病毒的生物学特性及致病性研究,VFcs突变重组病毒均具有增强膜融合与致细胞病变能力,对雏鸡的致病性增强,以r-25K增强最明显。r-3K、r-25K、r-235K具有破坏鸡脑渗透性的能力,其中r-25K作用最强。综合分析表明赖氨酸数量为2或3个时,NDV毒力、细胞膜融合能力和对雏鸡致病性明显增强。以上研究为深入了解VFcs及HR2区域对NDV的毒力和致病机制提供了更丰富的理论依据。