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大蒜是百合科葱属植物Allium Sativum L.的干燥鳞茎,其作为药食两用植物的历史悠久。研究表明,大蒜的生物活性成分主要含硫氨基酸及其代谢产物,具有抑菌杀菌、降血脂、抑制肿瘤等作用。本实验主要利用蒜氨酸酶的竞争性抑制剂S-烯丙基-L-半胱氨酸作为亲和层析配基,以琼脂糖和壳聚糖为载体,设计亲和层析柱,分离纯化了蒜氨酸酶,另外还用合成法制备了蒜氨酸。本研究主要成果如下:
(1)H2O2氧化S-烯丙基-L-半胱氨酸生成蒜氨酸最佳反应条件为:S-烯丙基-L-半胱氨酸浓度为50mg·mL-1;H2O2:S-烯丙基-L-半胱氨酸(mol:mol)为2:1,反应温度为70℃,反应时间1h,实验中的最高转化率为96.03%。
(2)制备以琼脂糖为载体的亲和凝胶,最佳配基浓度为100μmol半胱氨酸·g-1干胶,其偶联率为93.38%,抑制率为31.69%。
(3)利用PEG沉淀、重溶的粗酶液进行亲和层析得到的提纯蒜氨酸酶,与大蒜粉碎液相比,酶活力回收达到68.42%,比活力为9.493U·mg-1,纯化倍数达到22.28倍。SDS-PAGE结果显示,提纯蒜氨酸酶达到了电泳纯。
利用直接处理大蒜粉碎液的亲和层析方法得到的提纯蒜氨酸酶,与大蒜粉碎液相比,酶活力回收达到73.21%,比活力为11.701U·mg-1,纯化倍数达到17.99倍。SDS-PAGE结果显示,提纯蒜氨酸酶达到了电泳纯。利用HPLC对蛋白质溶液进行纯度测定,得到主峰的峰面积达到92.95%。
(4)提纯的蒜氨酸酶最适反应温度为35℃,最适反应pH为5.91,Lineweaver双倒数方程为y=0.3937x+0.0402,R=0.994,Km=9.845 mmol·L-1,Vmax=24.93 U·mg-1。
(5)制备以壳聚糖为载体的亲和凝胶,最佳配基浓度为200μmol半胱氨酸·g-1干胶,其偶联率为74.13%,抑制率为94.56%。
利用PEG沉淀、重溶的粗酶液进行亲和层析得到的提纯蒜氨酸酶,酶活力已丢失。SDS-PAGE结果显示,提纯蒜氨酸酶达到了电泳纯。利用HPLC对蛋白质溶液进行纯度测定,得到主峰的峰面积为91.43%。
(6)考察了大蒜辣素在溶液中的稳定性。三种有机溶液:甲醇、乙酸乙酯、环己烷,以及三个有机溶液:水溶液比例水平:1:2、1:1、2:1,利用HPLC对4℃条件保存于不同溶液体系下24h的大蒜辣素残留量进行分析。大蒜辣素极度不稳定,其残留量与溶液极性、有机溶液:水溶液比例相关。非极性溶液环己烷的残留量较低,最高残留量仅为36.84%,残留的大蒜辣素主要分布在水层。而极性溶液乙酸乙酯的大蒜辣素残留量较高,最高残留量达到61.44%,残留的大蒜辣素主要分布在有机层。