背景2019年末,新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARSCoV-2）引发的新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019,COVID-19）疫情暴发。截至2022年3月31日,全球确诊病例超4.8亿,已导致超过613万人死亡。因此,急需有效疫苗遏制疫情的发展。重组DNA疫苗引发类似于自然感染的免疫反应,有研发时间短,非冷链运输等优势。构建SARS-CoV-2 DNA疫苗可进一步研究不同结构蛋白作为疫苗靶标的免疫效果。目的构建表达SARS-CoV-2四种结构蛋白重组DNA疫苗,通过免疫BALB/c小鼠,全面评估各结构蛋白作为疫苗靶标诱导的特异性体液免疫水平,特异性细胞免疫水平,以及真病毒攻击后的保护情况。为新冠疫苗设计中靶标抗原的优化提供科学参考。方法疫苗靶抗原选用最原始的WH01株四种结构蛋白序列,密码子优化后,将其克隆到pc DNA3.1载体Hind III和Xba I酶切位点之间,将构建成功的质粒命名为p-SARSCoV-2-S/N/E/M。所有的DNA疫苗序列均通过Sanger DNA测序来证实,并且使用无内毒素的大提质粒试剂盒来提取质粒。获得质粒后,体外瞬时转染293T细胞,使用6 x His标签抗体/S蛋白特异性抗体/N蛋白特异性抗体进行间接免疫荧光检测（Indirect immunofluorescence assay,IFA）和免疫印迹实验（Western Blotting,WB）。通过免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,评估疫苗诱导的特异性体液免疫水平:用ELISA检测小鼠血清中抗原特异性Ig G抗体滴度;用假病毒和真病毒中和实验检测小鼠血清中抗原特异性中和抗体滴度。用酶联免疫斑点检测（Enzyme linked immunosorbent spot,ELISpot）评估细胞免疫应答水平。初次免疫后第125天,每组随机取4只小鼠进行攻毒实验。攻毒后3天,小鼠被执行安乐死,并进行肺组织采集。部分组织进行核酸提取和实时荧光RT-PCR,根据样本的CT值和标准曲线计算样本中病毒的半数组织培养感染剂量（Median tissue culture infective dose,TCID50）。其余的组织样本用4%福尔马林溶液固定,制备苏木精和伊红染色切片,用于病理评估,根据病变术语和诊断标准的国际统一项目（International Harmonization of Nomenclature and Diagnostic Criteria for Lesions in Rats and Mice,INHAND）评分进行病理学评价。结果1.免疫印迹实验和间接免疫荧光检测结果表明,p-SARS-CoV-2-S/N/E/M可在体外成功表达SARS-CoV-2-S/N/E/M蛋白。2.筛选到6条包含SARS-CoV-2 E蛋白、M蛋白特异性H-2d-限制T细胞表位肽。p-SARS-CoV-2-E/M疫苗免疫可诱导一定水平的细胞免疫,未检测到明显的体液免疫。攻毒结果显示,与空白对照组相比,免疫组病毒滴度无明显下降,但提供部分保护作用,与单独用p-SARS-CoV-2-E/M免疫的小鼠相比,p-SARS-CoV-2-E+M保护效果最好,表现出最轻微的组织病理学变化和最低的INHAND评分。3.p-SARS-CoV-2-S/S+N/S+E+M疫苗免疫均引起了特异性S蛋白体液免疫应答,与其他组比,S+N组S蛋白特异性结合抗体效价更高。假病毒中和试验显示,S+N组的中和抗体免疫应答趋势优于S组。真病毒中和试验显示,S+N组三免后的半数效应浓度（Median Effective Concentration,EC50）高于S组,差异有统计学意义（P=0.043）。二免后,S/S+N/S+E+M组疫苗免疫均引起了S蛋白特异性细胞免疫应答,组间差异无统计学意义。多重比较结果显示,与二免相比,三免后S组S蛋白特异性细胞免疫水平无明显差异,S+N组、S+E+M组S蛋白特异性细胞免疫水平提高有统计学意义（P＜0.001）。攻毒结果显示,S组、S+N组、S+E+M组疫苗免疫均对体重下降有保护作用,各免疫组肺部病毒未检测到活病毒,S+N组肺部RNA拷贝数下降近10000倍,与S组相比,差异有统计学意义（P=0.023）。与S组相比,S+N组、S+E+M组INHAND评分降低,S+E+M组INHAND评分最低。结论1.单独表达SARS-CoV-2 E蛋白、M蛋白的COVID-19 DNA疫苗免疫模型小鼠可提供攻毒后的部分保护;2.S+N组诱导更高的中和抗体水平,更高效降低肺部病毒载量;S+N/S+E+M组在三免后可诱导更高水平S蛋白特异性细胞免疫水平,且攻毒后肺部病理变化更轻。