鱼类CD36基因的组织分布、发育表达与功能研究

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CD36是一种多肽单链的跨膜糖蛋白,属于B类清道夫受体。在哺乳动物中CD36分布于多种组织细胞中,其在不同组织和细胞分化阶段也具有较大的表达差异,这种表达模式反映了CD36的功能多样性。研究认为,CD36具有广阔的配体结合特异性,使其参与多种生理和病理过程,如长链脂肪酸摄取、脂肪类食物的味觉感受、细胞粘附、炎症反应、血管再生和肥胖、动脉硬化、心肌病变等;此外也在内化及信号转导中发挥作用。目前对于CD36的研究主要集中于哺乳动物,而对鱼类中CD36的特性与功能却还一无所知。本论文主要以模式鱼类生物斑马鱼为研究对象,对斑马鱼CD36基因的组织定位、胚胎发育时期的时空表达及其功能进行了研究;同时以鲶鱼口须为实验材料,研究了CD36在味蕾中的定位。这是关于CD36基因在鱼类中首次研究,为全面探索CD36在鱼类中的功能奠定了基础。运用半定量RT-PCR方法对CD36基因在成体斑马鱼各组织中的表达水平进行了检测,发现斑马鱼CD36基因在被检测的各组织中均有表达,其中在肠中的表达量最高,其次在肝脏、脾脏、鳃及脑中有较高的表达量,在脊椎、肾脏和鳔中的表达量相对较少。在蛋白水平上,我们运用免疫组织化学技术对CD36蛋白在斑马鱼头部的表达进行了检测,发现其在斑马鱼唇中有表达,我们推测该表达部位可能是其味蕾(需要进一步验证)。运用实时定量PCR方法对斑马鱼CD36mRNA在胚胎不同发育时期中的表达水平进行了检测,发现CD36基因在胚胎不同发育时期均有表达,但其在胚胎不同发育时期的表达量有差异。其中在卵裂期及囊胚期表达量较高,随后表达量逐渐降低,在咽弓期达到最低,到孵化期又开始有所上升。我们进一步运用胚胎整体原位杂交技术检测了CD36的时空表达模式,发现CD36基因在胚胎发育早期在整个卵裂球中都有杂交信号,胚胎发育至体节期时,CD36基因杂交信号主要集中于头部和腹部,其他部位杂交信号微弱;胚胎孵化以后,CD36基因杂交信号仍集中在头部以及腹部,其他部位基本无杂交信号;在孵化后7d幼鱼中,CD36基因杂交信号基本集中于头部及腹部。对斑马鱼后期幼鱼原位杂交后的胚胎切片发现,CD36基因在味蕾分布组织和消化道组织中杂交信号十分显著。这种结果表明CD36在胚胎早期发育过程中发挥重要的作用。为了研究CD36是否在鱼类免疫中发挥作用,我们用不同抗原LPS、LTA刺激成体斑马鱼,运用实时定量PCR方法检测肝脏中CD36基因对不同抗原的响应。结果显示,CD36基因在受到不同抗原刺激后表达都明显上调,表明CD36参与斑马鱼的免疫应答。我们还用实时定量PCR技术检测了不同的营养摄食对斑马鱼幼鱼CD36表达的诱导作用。结果表明,禁食2周后突然高脂喂食CD36基因表达量下降;而高脂喂食2周后突然饥饿则CD36基因表达量上升。此外,亚油酸短暂刺激后可以诱导斑马鱼味觉感受组织中CD36的表达,推测CD36可能参与脂味觉的感受,但还需进一步研究。我们又选取味蕾发达的鲶鱼进行进一步探索,荧光免疫组织化学显示味蕾的标记分子5-HT特异在味蕾中表达,我们也对CD36在鲶鱼味蕾中的定位进行了研究,为进一步研究CD36在鱼类脂味觉的分子机制奠定了基础。
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