研究背景与目的压力性尿失禁(Stress urinary incontinence,SUI)是老年妇女的常见临床疾病,在老年妇女中的发病率高达27.6%,严重影响了广大妇女生活质量[1-3]。SUI的发病机制与女性盆底结构改变密切相关,目前已经得到妇产科学界的重视。手术治疗是SUI的常用治疗方法,悬吊术已成为SUI治疗的一线手术方式[4,5]。目前临床运用的吊带材料包括合成材料和生物材料[6]。合成材料因其具有组织侵蚀性强、瘢痕形成等难以克服的缺陷,不利于临床广泛推广。而经脱细胞处理的生物材料因保留了组织的完整性,且免疫源性低,已被广泛应用于组织工程和再生医学[7],脱细胞膀胱基质(Urinary bladder matrix,UBM)是生物材料的一种,初步研究表明其在SUI的治疗中具有一定的潜能[8],但面临的最大问题是降解周期短,从而导致SUI复发。一些学者提出将干细胞种植于生物材料上进行替代治疗可能是SUI的有效治疗手段[9],然而却存在着负载骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的UBM存在着BMSCs增殖率低以及向平滑肌细胞分化程度低的缺点[10],因此,如何提高UBM上BMSCs的增殖率及向平滑肌细胞分化率是目前亟待解决的热点问题。已有研究报道,Laminin蛋白通过其LG端功能域与BMSCs表面的整合素受体相结合从而促进BMSCs的增殖[11],并且有报道称将Laminin蛋白加入到培养人的骨髓间充质干细胞培养基中,作为体外扩增人的骨髓间充质干细胞的一种常用方法[12]。同时,Laminin蛋白可促进BMSCs向成骨细胞、骨细胞等方向分化[13]。而Laminin蛋白不仅是构成UBM材料基底层的基本结构,而且是UBM基底层最重要的功能蛋白[14]。但是UBM上的Laminin蛋白是否具有促进负载BMSCs增殖及向平滑肌细胞分化的功能尚不明确。结合我们的前期研究发现经过脱细胞处理后的UBM上Laminin蛋白的LG域在基底层面处于向外的游离状态,而通过交联剂交联后可使部分LG域相互融合而丧失功能[15],由此进一步证明Laminin蛋白的LG功能域在BMSCs增殖、迁移以及分化中的作用。因此,我们推测ubm上的laminin蛋白也具有促进bmscs增殖及向平滑肌细胞分化的功能,探讨ubm上laminin蛋白的这一功能,对现有的ubm进行改善,从而为sui新型生物材料的构建奠定基础。1实验方法1.1bmscs的制备采用全骨髓贴壁法分离、培养3-4周雌性sd大鼠的bmscs,运用流式细胞学技术检测bmscs的免疫表型,进行干细胞鉴定,将p3代bmscs作为种子细胞。1.2ubm的制备采用机械分离和酶消化等方法对新鲜猪膀胱进行处理,达到脱细胞目的,进行冷冻干燥、消毒灭菌后密封保存,作为组织工程材料。1.3ubm复合材料的制备采用蛋白孵育法,制备ubm+laminin材料以及ubm+anti-laminin材料,进行免疫组化学检测laminin蛋白在复合材料组及单纯ubm组的表达情况。1.4.ldh检测bmscs活性取p3代bmscs,按3000/孔接种于96孔板,实验组为ubm+laminin组、ubm组和ubm+anti-laminin材料,每孔加120μl的细胞培养液,每组设置5个复孔,置于37℃,5%co2及饱和湿度下培养,隔日换液,并观察培养液有无浑浊。分别取培养1d、3d、5d、7d、9d细胞上清液行ldh检测。1.5ckk8检测bmscs增殖实验组分为3组,分别为:ubm+laminin组、ubm组和ubm+anti-laminin组。每组5个附孔,每孔3000个bmscs接种于96孔板,于培养1、3、5、7、9、12、14天的组织行cck8检测。1.6he染色观察bmscs迁移情况将p3代bmscs(1×105/cm2)接种于三组材料上,定期观察培养液有无浑浊,于接种3d、5d、7d、14d的组织行he染色,定向观察bmscs在不同材料上的迁移情况。1.7免疫组化学技术检测bmscs向smc分化情况取接种第14天的组织行免疫学检测bmscs表达α-sma情况,观察bmscs向平滑肌细胞分化情况。1.8统计学分析统计学分析应用spss17.0统计软件,计量资料以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析。2实验结果2.1bmscs的分离、培养及鉴定显微镜下观察原代分离的bmscs呈漩涡状、贴壁生长,杂细胞较多,培养1周后细胞融合达90%。传代后细胞较均一,形态规则,呈长梭型,增殖快。流式细胞学技术检测bmscs表达中胚层来源分子cd29,阳性率为98.0%,表达内皮细胞特征分子cd31,阳性率为4.56%,表达造血干细胞系特征分子cd34,阳性率为3.30%,符合bmscs的特征。2.2ubm的制备肉眼观察ubm材料呈致密均匀的半透明的膜状组织,显微观察ubm由致密均匀的胶原纤维和基质组成,扫描电镜观察ubm的胶原分布致密均匀,纤维完整,未见细胞残留。2.3ubm复合材料的制备免疫组化学检测ubm材料表明laminin蛋白主要分布于基底层面,部分位于非基底层,laminin蛋白孵化ubm组laminin蛋白表达明显增高,anti-laminin组表达明显下降,表明材料上部分蛋白可以被抗体封闭。2.4三组材料负载bmscs的活性共培养5天,ubm+anti-laminin组ldh检测值明显升高,表明死亡细胞数目增多。三组材料上bmscs的ldh值均在培养第7天达高峰,7-9天ldh曲线呈平行趋势。ubm+anti-laminin组ldh检测值明显高于其余两组,而ubm+laminin与ubm无明显的差异。2.5三组材料bmscs生长情况运用cck8检测方法表明三组材料均能支持bmscs生长,三组细胞生长曲线类似,培养1周内,细胞处于潜伏适应期,培养1周后细胞呈对数生长,培养9天后细胞生长基本到达平台,ubm+laminin组对bmscs增殖有显著促进作用。2.6he染色观察bmscs迁移情况取共培养3、5、7、14天组织行he染色观察,三组材料均能支持细胞粘附生长,培养3天发现ubm+laminin组材料表面有多层细胞附着,细胞密度明显高于其他两组,随接种时间延长,可见细胞明显向深层迁移,培养14天,部分细胞到达材料基底层,且细胞形态发生改变,细胞核拉伸延长。ubm组bmscs主要集中在材料表面生长,部分向深层迁移,而ubm+anti-laminin组共培养期间细胞依旧粘附在材料表面,仅个别细胞向深层迁移。2.7免疫组化学技术检测BMSCs向SMC分化情况共培养14天,免疫组化学检测BMSCs中平滑肌标记性蛋白α-SMA的表达发现UBM+Laminin组表达强阳性,UBM组呈弱阳性,而UBM+Anti-Laminin组则表达阴性。结论1.分离培养了纯度较高的BMSCs;2.成功制备了UBM材料;3.构建了UBM+Laminin复合材料以及UBM+Anti-Laminin复合材料;4.研究表明UBM上的Laminin蛋白具有促进负载BMSCs增殖、迁移以及向平滑肌分化的能力。