金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类普遍存在的低分子量(6-7KD)，富含半胱氨酸的金属结合蛋白。MT对维持一些必需金属的体内代谢平衡及抵抗有毒金属毒性、清除自由基有重要意义。近年来，MT和肿瘤的关系成为研究的热点。MT参与肿瘤细胞增殖、凋亡、分化以及化疗耐药，影响治疗和预后。人类MT基因位于染色体16q13，包括10个功能性基因：MT2A、MT1A、MT1B、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X、MT3和MT4。研究表明，不同金属硫蛋白异构体在人发育或在不同生理条件下可能功能不同。各种MT异构体有独特的功能。目前，各个异构体的功能尚不清楚，研究比较多的是MT2A异构体，对于MT1H资料甚少。 因此，本课题我们首先利用半定量RT-PCR方法、免疫组化方法分别检测了68例NSCLC组织及25例良性肺组织中MT1H mRNA和IMT蛋白表达水平，探讨其在NSCLC发病中的作用和临床意义；然后研究外源性MT1H基因对肺腺癌细胞株A549生物学行为及化疗敏感性的影响，并应用siRNA干扰A549顺铂耐药株A549/DDW中MT1H的表达，反证MT1H在肺癌耐药中的作用；并进一步分析46例NSCLC患者化疗前后外周血MT1H表达情况和顺铂耐药性的关系。通过对肺癌细胞系和临床标本的研究，不但为NSCLC的发生、发展提供理论依据，而且为NSCLC患者化疗药物耐药性寻找新的靶点提供了理论依据。 本实验分为以下四部分： 第一部分MT1H在人非小细胞肺癌及肺腺癌细胞株中的表达方法： 1．采用半定量RT-PCR技术检测68例NSCLC组织及25例良性肺病变组织、肺腺癌A549细胞株及其顺铂耐药株A549/DDP中MT1H mRNA的表达。 2．采用免疫组化技术对68例NSCLC组织及25例良性肺病变组织中MT蛋白的表达进行检测。 3．统计学处理：利用SPSS10.0软件处理数据，结果用阳性率表示，采用x<2>检验；相关性分析采用Pearsons相关分析。以α=0.05为显著性。 结果： 1．68例NSCLC组织中28例MT1H mRNA表达阳性，阳性表达率为41.2％，25例良性肺病变组织均不表达。 2．68例NSCLC组织中47例MT蛋白表达阳性，25例良性肺病变组织中7例表达阳性。阳性表达率分别为69.1％、28.0％。两者对比差异有统计学意义(P<0.05)。 3．MT1H mRNA在高中分化NSCLC中表达阳性率为25.9％，在低分化NSCLC中阳性率为51.2％，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。而且，肿瘤分化程度越低，阳性率越高。MT1H mRNA表达与性别、年龄、组织学类型、TNM分期、淋巴结转移与否均无关(P>0.05)。 4．MT蛋白在高中分化NSCLC中表达阳性率为44.4％，在低分化NSCLC中阳性率为85.4％，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。而且，肿瘤分化程度越低，阳性率越高。此外，在<60岁的患者中阳性率为57.9％，而在>60岁的患者中阳性率为83.3％，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。MT1H蛋白表达与性别、组织学类型、TNM分期、淋巴结转移与否均无关(P>0.05)。 5．在MT蛋白表达阳性的47例标本中，MT1H mRNA阳性表达28例，阴性表达19例；在MT蛋白表达阴性的21例标本中，MT1H mRNA也全呈阴性表达；经统计学分析，两者呈正相关关系(P<0.05)。 6．MT1H mRNA在A549/DDP细胞株中高表达而在A549细胞中不表达。 第二部分MT1H基因在真核细胞中的表达及其对细胞生长、细胞周期和顺铂耐药性的影响 第一章 MT1H基因真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达方法： 1．用PCR法从含MT1H基因的质粒pACT2-MT1H中获得目的基因cDNA片段，正向插入真核表达质粒pcDNA3.1/myc-his(-)中，构建MT1H重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)-MT1H。 2．把pcDNA3-1(-)-MT1H以脂质体法转染不表达MT1H的A549细胞，同时转染空质粒pcDNA3.1(-)作为对照。经G418筛选，获得阳性单克隆细胞。 3．采用半定量RT-PCR和Western blot技术检测转染前后A549细胞MT1HmRNA和蛋白的表达。 第二章 MT1H基因对A549细胞生长和细胞周期的影响方法： 1．采用MTT方法检测MT1H转染对A549细胞增殖的影响。 2．采用流式细胞术检测MT1H转染对A549细胞周期的影响。 3．采用RT-PCR方法检测MT1H转染对A549细胞周期蛋白CyclinD1的影响。 4．统计学处理：结果用均数士标准差(x±s)表示，采用SPSS10.0统计软件包，两组均数的比较用t检验，多组均数的比较用方差分析(ANVOA)，以α=0.05为显著性。 第三章 MT1H基因对A549细胞耐药性的影响方法： 1．采用MTT方法检测未转染组、空质粒转染组和MT1H转染组细胞对顺铂(DDP)的药物敏感性，并计算细胞对DDP的IC<,50>值。 2．上述3组细胞分别与5μg/ml和10μg/ml顺铂共同孵育24 h，用AnnexinV-FITC和PI双染，然后上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 3．统计学处理：结果用均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS10.0统计软件包，两组均数的比较用t检验，多组均数的比较用方差分析(ANVOA)，以α=0.05为显著性。 第三部分siRNA干扰MT1H基因对A549/DDP细胞耐药性的逆转方法： 1．将终浓度为10 nM的MT1H siRNA转染到耐顺铂A549细胞(A549/DDP)中同时转染非特异siRNA作为对照组。 2．RT-PCR和Dot blot、免疫组化法检测转染48 h后MT1H mRNA和MT蛋白的表达水平。 3．MTT法检测不同浓度DDP对MT1H siRNA转染组和非特异siRNA转染组细胞作用24 h后细胞的存活率，并计算细胞对DDP的IC<,50>值。 4．未转染组、非特异siRNA转染组和MTlH siRNA转染组细胞联合化疗药物DDP作用24 h后，用Annexin V-FITC和PI将细胞双染，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 5．未转染组、非特异siRNA转染组和MT1H siRNA转染组细胞联合化疗药物DDP作用24 h后，采用TUNEL法检测细胞凋亡情况。 6．免疫组化方法检测MT1H siRNA转染前后Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。 7．统计学处理：结果用均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS10.0统计软件包两组均数的比较用t检验，多组均数的比较用方差分析。 第四部分非小细胞肺癌患者外周血中MT1H mRNA的表达与顺铂耐药性的关系方法： 1．46例非小细胞肺癌初治患者，用含顺铂方案化疗两周期后评价疗效，收集化疗前后外周血，采用RT-PCR方法检测MT1H mRNA表达情况，并探讨其和近期化疗疗效的关系。 2．统计学处理：结果用均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS10.0统计软件包，进行t检验，以α=0.05为显著性。 结论 1．MT蛋白在非小细胞肺癌组织和肺良性病变组织中表达存在差异，并且在癌组织中表达与分化程度、年龄有关。MT1H mRNA在非小细胞肺癌组织和肺良性病变组织中表达存在差异，并且在癌组织中表达与分化程度有关。提示MT蛋白和MT1H可能参与非小细胞肺癌的发生、发展。 2．MT1H能够促进肺腺癌细胞A549增殖，可能和上调CyclinD1，促使细胞进入S期增多有关。 3．MT1H能促进A549细胞对顺铂耐药，可能和抑制细胞凋亡有关。 4．siRNA干扰MT1H表达，能降低Bcl-2表达，增强顺铂对A549/DDP细胞凋亡的诱导作用，有效逆转A549/DDP细胞耐药，在未来可能发展成为非小细胞肺癌一种新的治疗方法。 5．晚期非小细胞肺癌患者，化疗前外周血中MT1H mRNA表达和顺铂化疗疗效无关，提示MT1H和顺铂的原发性耐药无关。化疗后MT1H mRNA表达明显升高，有效组化疗前后无差别，无效组化疗前后有差别，提示MT1H可能和顺铂的继发性耐药有关。