【摘 要】
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水稻作为固着植物需要面对不断变化的外部环境,其中就有危害植物生长发育的不良环境。为了应对这些危害,植物进化出了不同的防御机制,其中蛋白的磷酸化和去磷酸化修饰发挥了关键的作用。水稻类受体胞质激酶LRRK1是一类不具有胞外结构域的类受体激酶,实验室前期通过质谱手段分析从水稻体内IP下来的LRRK1复合体鉴定到了一个水稻14-3-3蛋白GF14f。在植物中,14-3-3蛋白作为一个桥梁蛋白,广泛地参与了
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水稻作为固着植物需要面对不断变化的外部环境,其中就有危害植物生长发育的不良环境。为了应对这些危害,植物进化出了不同的防御机制,其中蛋白的磷酸化和去磷酸化修饰发挥了关键的作用。水稻类受体胞质激酶LRRK1是一类不具有胞外结构域的类受体激酶,实验室前期通过质谱手段分析从水稻体内IP下来的LRRK1复合体鉴定到了一个水稻14-3-3蛋白GF14f。在植物中,14-3-3蛋白作为一个桥梁蛋白,广泛地参与了植物生理生化过程。因此,为揭示LRRK1与GF14f的具体分子机制,本研究将通过分子与生物化学实验分析了2个蛋白的互作情况,并鉴定其磷酸化位点。具体研究结果如下:（1）通过生物信息学分析发现,OsGF14f在水稻所有组织中都有表达。对蛋白磷酸化位点预测发现,OsGF14f含有丰富的磷酸化位点,并推测LRRK1与GF14f可能存在相互作用,且GF14f是LRRK1磷酸化的底物蛋白。（2）亚细胞定位实验结果显示,GF14f定位于细胞质中。酵母双杂交、GST pull-down和BiFC等3个独立实验证明,LRRK1和GF14f存在直接相互作用,且其互作场所位于细胞膜上。（3）原核表达和纯化LRRK1和GF14f,并于体外磷酸化反应体系中孵育,然后磷酸化抗体的Western blot分析发现,添加了ATP的实验组相对于不添加ATP的对照组,GF14f的丝氨酸磷酸化信号显著增强,说明LRRK1可以磷酸化GF14f。（4）对体外磷酸化的GF14f进行质谱分析,共鉴定到9个磷酸化位点,其中3个苏氨酸位点:T224、T235和T238,6个丝氨酸位点:S78、S100、S112、S143、S160和S239。（5）将GF14f的相关磷酸化位点突变为丙氨酸以模拟去磷酸化,再于体外与LRRK1孵育并用磷酸化抗体检测发现,当GF14f的S78突变为丙氨酸后,其磷酸化信号显著下降,说明S78为LRRK1磷酸化GF14f的主要磷酸化位点。我们推测,LRRK1可能是通过磷酸化GF14f的S78位点来完成相关信号的级联转导。综上所述,本研究证明了水稻类受体胞质激酶LRRK1可以与水稻14-3-3蛋白家族中的GF14f相互作用,并初步发现LRRK1主要磷酸化GF14f的S78,推测LRRK1可能通过磷酸化GF14f的S78位点来完成磷酸化信号的传递。该研究结果为后续解析水稻LRRK1和14-3-3蛋白参与的信号转导机制提供了一定的前期基础。
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