核酸作为一类重要的内源性调控分子,其含量变化往往与疾病的发生、发展和转移等重要生理过程密切相关,因此作为一种理想的生物标志物,核酸在肿瘤早期诊断和术后监测等方面具有重要意义。目前已发展核酸检测的传统方法主要有凝胶电泳、同位素标记、聚合酶链式反应（PCR）等,因其存在灵敏度低、操作复杂以及成本高等缺陷,而限制其广泛应用。此外,在肿瘤的早期阶段,核酸的表达含量极低,因此发展核酸的高灵敏检测新方法至关重要。核酸外切酶Ⅲ（Exo-Ⅲ）是一种核酸水解酶,具有灵敏度高、特异性好等优势。基于此,本文以发展核酸高灵敏、高特异性检测新方法为目标,利用核酸外切酶Ⅲ（Exo-Ⅲ）能实现靶标循环放大能力,结合杂交链式反应（HCR）和核酶（DNAzyme）的信号放大技术,发展了两种基于核酸外切酶Ⅲ辅助靶标循环的级联放大策略,分别以p53基因和miRNA为研究对象,开展了疾病相关核酸标志物的检测研究,并分别考察其在血清样品和细胞培养液中的检测能力。具体研究内容如下:1.基于Exo-Ⅲ辅助靶标循环结合HCR的级联信号放大技术用于DNA的检测研究利用Exo-Ⅲ辅助的靶标循环放大技术,结合HCR信号放大技术,成功发展了一种简便、等温的级联信号放大策略用于核酸检测。该方法包括两步步骤,其中第一步骤由触发探针Trigger、辅助探针L组成,用于实现靶标循环放大;第二步骤由触发HCR的发夹探针H1和H2组成,以实现信号放大目的。当靶标存在时,靶标能与触发探针和辅助探针L的杂交双链中辅助探针的游离序列杂交,形成3′端平齐的双链结构,在Exo-Ⅲ的水解作用下能切割辅助探针,从而释放出靶标和触发链,释放出的靶标能继续参与下一轮的循环,从而产生更多的触发序列;而释放出的触发链Trigger能参与第二步骤反应,触发HCR反应,实现信号放大。以靶标p53基因为研究对象,实验结果表明,该传感策略能实现靶标p53基因的灵敏检测,检测限达到2.0 p M。同时该方法还能实现血清中靶标的检测,具有较好的特异性和稳定性,有望为临床实际样品研究提供新契机。2.基于Exo-Ⅲ辅助靶标循环结合DNAzyme的级联信号放大技术用于miRNA的高灵敏检测研究为了进一步提高检测方法灵敏度,在本工作中引入DNAzyme（P1）信号放大技术,同时利用Exo-Ⅲ辅助的靶标循环放大能力,开发了一种级联信号放大方法实现靶标miRNA的高灵敏检测。该方法由两步循环组成,其中循环I由DNAzyme、辅助探针P2组成,以实现靶标循环放大为目标;循环II由含有RNA位点的报告探针（MB）组成,以实现信号放大目的。首先,在循环I中,当靶标不存在时,DNAzyme和辅助探针（P2）杂交,形成双链结构,此时露出P2的部分游离序列。当靶标存在时,靶标与辅助链P2的游离序列杂交,形成3′端平齐的双链结构,经过Exo-Ⅲ的水解作用释放出靶标和DNAzyme,释放出的靶标可以参与下一轮的靶标循环过程,从而产生更多触发序列;而释放出的DNAzyme能参与第二步循环反应,在辅助因子锌离子的协助下,不断切割底物链,导致荧光基团和淬灭基团远离,实现荧光放大。实验结果表明,该方法能实现靶标miRNA-21的高灵敏检测,检测限低至0.19 fM,且具有很好的选择性。同时该方法还可用于细胞裂解液中靶标的灵敏检测,有望为肿瘤标志物的高灵敏检测研究提供新的方法与技术。