论文部分内容阅读
目的:近年来,肉碱/有机阳离子转运体1（Carnitine/organic cation transporter1,OCTN1）在中枢神经系统的生理作用逐渐被学者们关注,多项研究发现其经典底物麦角硫因（Ergothioneine,EGRO）在体外实验中有改善氧化应激状态和抑制炎症的活性。然而,OCTN1转运体在帕金森病（Parkinson’s disease,PD）疾病进程中是否发挥作用尚未明确。本研究使用N-甲基-4-苯基吡啶鎓阳离子（N-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+）诱导BV2细胞来构建PD神经炎症模型,探究OCTN1转运体的表达和功能是否会在PD状态下发生改变,以及OCTN1转运体底物ERGO是否在此模型中有潜在治疗效果。方法:（1）MPP+-BV2细胞模型构建:BV2细胞在种板24 h后用含100μM MPP+的无血清培养基培养12 h,光学显微镜下观察造模剂诱导前后细胞的形态;流式细胞仪检测ROS荧光强度;免疫荧光染色检测NF-κB p65核因子易位情况;实时荧光定量PCR（q PCR）测定炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）和OCTN1的mRNA转录水平;免疫印迹（WB）测定OCTN1总蛋白、膜蛋白、胞浆蛋白以及BV2细胞激活标志物Iba-1蛋白的表达水平;ELISA试剂盒测定BV2细胞分泌的IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白水平。（2）ERGO摄取实验:为验证OCTN1蛋白在造模剂诱导前后的摄取功能变化情况,选取了OCTN1特异性底物ERGO来考察BV2细胞在造模剂诱导前后对ERGO摄取的变化情况。时间依赖性:使用含500μM ERGO的摄取缓冲液分别孵育细胞0、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6 h后收集样本并使用LC-MS/MS测定浓度,并用BCA试剂盒测定的蛋白浓度进行校正;浓度依赖性:含0、20、50、100、200、500、1000、2000μM ERGO的摄取缓冲液孵育细胞1 h,收集样本后进行浓度测定并校正;造模剂对摄取影响:使用0、25、50、100μM MPP+孵育BV2细胞12 h后,再使用含500μM ERGO的摄取缓冲液孵育1 h,收集样本后进行浓度测定与校正;抑制剂对摄取影响:使用含100μM奎尼丁和500μM ERGO的摄取缓冲液对BV2细胞进行孵育1 h后收集样本后进行浓度测定与校正。（3）BV2细胞上敲低OCTN1及验证:使用si-Octn1靶向干扰BV2细胞的Octn1基因从而干扰敲低OCTN1蛋白水平,WB测定OCTN1蛋白表达量;LC-MS/MS测定ERGO摄取量并校正。（4）ERGO抗氧化应激研究:分别使用含0、75、150、300μM ERGO与100μM MPP+的无血清培养基共同孵育12 h后流式细胞术检测ROS荧光强度;GSH检测试剂盒和一氧化氮检测试剂盒测定GSH和NO产物的浓度。（5）ERGO抑制NF-κB和MAPK信号通路作用研究:分别使用含0、75、150、300μM ERGO与100μM MPP+的无血清培养基共同孵育12 h后利用WB实验测定相关蛋白的表达水平;ELISA试剂盒测定炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的分泌水平。（6）分子对接研究ERGO抑制炎症机制:使用Autodock软件对ERGO和相关炎症通路进行分子模拟对接,获取结合能、作用位点、空间结构等信息;使用STRING数据库检索与OCTN1相关联的蛋白,寻找潜在的可与ERGO发生相互作用的靶蛋白。结果:（1）MPP+-BV2细胞模型评价:光学显微镜观察结果显示使用100μM MPP+孵育12 h后观察到BV2细胞体态肿大,细胞分枝状的触角变短,与成功造模的形态学特征相吻合;100μM MPP+核荧光和NF-κB p65荧光信号重叠程度高,表明100μM MPP+干预BV2细胞可以有效的使NF-κB核因子易位;WB实验结果显示100μM MPP+可分别使BV2细胞激活标志物Iba-1蛋白、OCTN1总蛋白、OCTN1膜蛋白的表达量提升至1.58、1.92、1.66倍;模型组细胞的IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA转录水平和蛋白分泌水平显著升高;模型组细胞的ROS水平显著提升,GSH水平显著降低。（2）ERGO摄取实验:时间依赖性实验表明1 h处于线性摄取范围内,是较佳的摄取时间;浓度依赖性实验表明500μM的底物浓度处于线性摄取范围内,是合理的底物浓度;0、25、50、100μM MPP+孵育BV2细胞12 h后,Vmax值依次变大,Km值依次变小,表明造模剂的剂量增大时,OCTN1的摄取功能也随之上调;抑制实验表明100μM奎尼丁可以在对照组和模型组细胞中有效抑制ERGO的摄取,相对抑制率分别为28.63%、72.93%,结果表明模型组BV2细胞的ERGO摄取更易受到抑制。（3）BV2细胞上敲低OCTN1:使用靶向Octn1的si-RNA可以使OCTN1的蛋白含量降至32.77%,ERGO摄取实验表明敲低OCTN1后,摄取含量降至36.90%,表明OCTN1的摄取功能显著降低,敲低效果较为理想。（4）ERGO抗氧化应激:高剂量治疗组（300μM ERGO）可以有效的降低ROS的平均荧光强度（由171.35%降至124.94%）、提高GSH浓度（由44.43%升至60.74%）、降低NO产物浓度（由191.19%降至157.38%）、降低i NOS蛋白表达水平（由191.53%降至158.18%）。在敲低OCTN1后,以上的治疗效果均显著减弱,表明ERGO抗氧化应激的作用是OCTN1摄取所介导的。（5）ERGO抑制炎症:高剂量治疗组（300μM ERGO）可以有效的降低炎症因子IL-6（由155.28%降至112.92%）、IL-1β（由148.85%降至106.07%）、TNF-α由（156.59%降至89.98%）、p-p65（由180.87%降至104.46%）、p-IκBα（由181.60%降至101.59%）、p-p38（由189.17%降至108.87%）、p-ERK（由168.66%降至107.01%）、p-JNK（由195.69%降至101.89%）的蛋白水平。免疫荧光结果显示300μM ERGO治疗后NF-κB p65荧光区域与核荧光区域重叠减少,表明NF-κB通路的激活被抑制。在敲低OCTN1后,以上的治疗效果均显著减弱,表明ERGO抗炎症的作用是OCTN1摄取所介导的。（6）分子对接:ERGO与NF-κB p50的结合能为-5.75 kcal/mol,抑制常数为61.85μM,提示ERGO对于NF-κB通路有着一定的抑制作用;ERGO与MAPK通路ERK1蛋白的结合能为-6.17 kcal/mol,抑制常数为30.16μM,提示ERGO对于MAPK通路有着一定的抑制作用;ERGO与AKT1-p H位点的结合能为-5.74 kcal/mol,抑制常数为62.30μM,提示ERGO对于PI3K/AKT通路可能有抑制作用;ERGO与酪氨酸受体激酶的结合能为-5.32 kcal/mol,抑制常数为126.09μM,提示SYK蛋白为ERGO潜在的治疗靶点。结论:此项研究成功使用MPP+诱导BV2细胞激活来构建PD神经炎症模型,模型组细胞OCTN1的mRNA水平、蛋白水平和摄取功能均显著上调。ERGO通过降低ROS、NO产物浓度,以及提高GSH浓度来发挥调节氧化应激的作用;通过抑制炎症因子分泌、抑制NF-κB和MAPK信号通路激活来发挥抗炎症作用。敲低OCTN1后,以上作用均显著减弱,表明ERGO的治疗作用是通过OCTN1摄取所介导的。分子对接结果显示ERGO对NF-κB和MAPK通路存在抑制作用,也可能对PI3K/AKT信号通路和酪氨酸受体激酶存在抑制作用。