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目的: 为明确CD166基因与鼻咽癌放射敏感性的关系,应用RNA干扰技术沉默放射抗拒鼻咽癌CNE-2R细胞中CD166基因,再通过相关细胞功能学实验探究其对CNE-2R细胞放射敏感性的影响及可能机制。 方法: 1、设计合成三组针对CD166/ALCAM基因的特异性siRNA,构建慢病毒shRNA载体,转染CNE-2R细胞,通过倒置荧光镜观察转染率。 2、采用qRT-PCR实验检测三组慢病毒shRNA载体对目的基因的抑制效果,筛选出沉默效果最佳的靶点,再通过Western blot实验验证该靶点的抑制效果。 3、通过克隆形成实验检测CD166/ALCAM基因沉默前后CNE-2R细胞的放射敏感性。 4、通过CCK-8法检测CD166/ALCAM基因沉默前后CNE-2R细胞增殖率的变化。 5、流式细胞术检测CD166/ALCAM基因沉默前后CNE-2R细胞凋亡率的变化。 6、流式细胞术检测CD166/ALCAM基因沉默前后CNE-2R细胞周期分布的变化。 结果: 1、慢病毒shRNA载体构建成功(滴度为5×108TU/mL);转染CNE-2R细胞后,使用荧光倒置显微镜观察,显示各组感染效率高(均在90%以上),提示转染成功。 2、通过qRT-PCR筛选出三个靶点中最佳干扰靶点CD166-RNAi-LV3,Western blot验证了最佳靶点CD166-RNAi-LV3的抑制效果。 3、克隆形成实验结果显示:CD166-RNAi-LV3组与未转染CNE-2R组、阴性对照NC组相比,D0、Dq及SF2值均减小,放射增敏比为1.477。 4、CCK-8实验结果显示:在2,4,6和8Gy照射后CD166-RNAi-LV3组细胞的增殖率均显著低于未转染CNE-2R组和阴性对照NC组(F=16.716-57.675,p<0.05)。 5、细胞凋亡实验结果显示:10Gy照射前,CD166-RNAi-LV3组、阴性对照NC组和未转染CNE-2R组凋亡率分别为(15.60±1.57)%、(8.60±1.80)%和(7.47±0.58)%;10Gy照射后,CD166-RNAi-LV3组、阴性对照NC组和未转染CNE-2R组凋亡率分别为(39.83±3.43)%、(20.53±1.81)%和(19.43±2.97)%。在照射前后,CD166-RNAi-LV3组细胞的凋亡率均高于未转染CNE-2R组和阴性对照NC组(F=28.90、49.635,p<0.05)。 6、细胞周期结果显示:CD166-RNAi-LV3组、阴性对照NC组和未转染CNE-2R组G2/M期所占比例分别为(26.40±1.76)%、(13.30±3.24)%和(13.50±1.31)%,CD166-RNAi-LV3组G2/M所占比例明显高于阴性对照NC组和未转染CNE-2R组(F=33.208,p<0.05);CD166-RNAi-LV3组、阴性对照NC组和未转染CNE-2R组S期所占比例分别为(3.30±0.10)%、(12.23±1.67)%和(10.27±0.64)%,CD166-RNAi-LV3组S期所占比例明显低于阴性对照NC组和未转染CNE-2R组(F=62.036,0<0.05);CD166-RNAi-LV3组、阴性对照NC组和未转染CNE-2R组G0/G1期所占比例分别为(67.37±2.06)%、(67.37±3.78)%和(70.4±1.87)%,三组间差异无统计学意义(F=1.253,0>0.05)。 结论: 通过PCR及WB验证,RNA干扰技术可对鼻咽癌放射抗拒CNE-2R细胞CD166/ALCAM基因进行有效抑制。通过细胞功能实验结果提示,沉默CD166/ALCAM基因可能通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、改变细胞周期分布等增强CNE-2R细胞对放射线的敏感性,提示对CD166/ALCAM基因进行沉默很可能是提高鼻咽癌患者放疗敏感性的有效治疗手段之一。