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作为传统的中药，丹参（Salviamiltiorrhiza Bunge）很早就被记载于《神农本草经》，其对心、脑血管系统疾病的临床治疗具有很重要的作用。作为丹参主要活性成分的丹参酮及丹酚酸等，都具有抗氧化、抗癌、消炎及抑菌等多种生物活性，因此，丹参被如此广泛的应用在临床的研究中。然而，野生丹参的资源日益缩减，其质量退化严重，栽种所需的周期较长，且具有药用价值的成分含量也偏低，因此很大程度上不能满足在市场上的需求，这使得如何得到优质且高产的丹参原药材来满足临床研究的需求成为现阶段的一个研究热点。
本课题采用代谢工程的研究手段，对丹参酮的生物合成途径进行了遗传改造，首次将位于丹参合成途径上游MEP途径中的关键酶基因1-脱氧-D-木酮糖合成酶（1-deoxy-D-xylulose5-phosphate synthase，DXS)基因的其中一个家族成员SmDXS2同位于下游途径中的重要酶基因牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶（Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS）基因共同遗传转化丹参。在农杆菌C58C1的介导下，将含有SmDXS2或/和SmGGPPS的植物表达载体（pCAMBIA1304++SmDXS2/SmGGPPS）在野生丹参的叶片中进行遗传转化，得到不同克隆的转基因丹参毛状根。分析合成途径中一些重要酶基因在PCR鉴定为阳性的转基因毛状根系中的表达情况，并检测阳性毛状根系中丹参酮及其他活性物质（丹酚酸、植物激素类等）的含量，同时通过抗肿瘤活性实验和抗氧化实验对转基因的丹参毛状根当中的丹参酮粗提物的抗癌活性和抗氧化活性进行了验证，进一步显示了关键酶基因SmDXS2和SmGGPPS在丹参酮生物合成中所发挥的作用。为了研究这两种基因对模式植物拟南芥的次级代谢产物的影响，通过农杆菌GV3101对拟南芥进行遗传转化，初步对拟南芥中叶绿素、类胡萝卜素及一些植物激素的含量进行测定。最后，通过添加生物诱导子对筛选后高产的丹参转基因毛状根系进行丹参酮产量进一步的诱导提高，并对相关基因表达情况进行了分析，所取得的实验结果如下：
1.组织表达谱分析：对野生丹参植株的叶片、茎、叶柄、须根和主根中SmDXS2和SmGGPPS基因的表达量进行了相对分析，两者都是在根中的表达量最高，在其他组织当中几乎没有表达。
2.亚细胞定位：在之前研究工作的基础上，完成了植物表达载体pEGAD+SmGGPPS的构建，并将质粒导入农杆菌EHA105中。再通过对烟草进行瞬时转化，发现GFP::GGPPS cDNA融合蛋白定位在细胞膜和细胞核中。
3.丹参和拟南芥的遗传转化及阳性鉴定：运用农杆菌介导法对无菌的丹参叶片和拟南芥的花进行侵染，分别得到了毛状根系：SmDXS2（58个）、SmGGPPS（50个）和SmDXS2-SmGGPPS（60个）；拟南芥株系SmDXS2（54个）、SmGGPPS（54个）和SmDXS2-SmGGPPS（60个）。通过PCR扩增检测，结果分别获得毛状根含有SmDXS2、SmGGPPS和SmDXS2-SmGGPPS阳性克隆11、14、25个，阳性率为18.97%、28.00%和41.67%；拟南芥含有SmDXS2、SmGGPPS和SmDXS2-SmGGPPS阳性克隆14、15、18个，阳性率25.93%、27.78%、30%。
4.转录水平的检测：从MVA途径上游的HMGR基因表达来看，在单转基因GGPPS和DXS2毛状根系中未能促使其表达量增加，而在双转根系中则都有所提高，但提高倍数不多；上游DXS家族中的两个基因DXS1和DXS2表达有所不同，DXS1基因在GD34根系中表达量低，相反DXS2在GD34根系中表达量却很高；单转和双转根系中DXR的表达量都比对照低，下游的GGPPS，在各根系中的表达量都有了很大的变化，其中在单转根系中的表达量相对于对照有了至少6倍的提高，而在双转根系中则提高了17倍，说明转入这两个基因对下游代谢基因起到了一定的调控作用。
5.次级代谢产物含量的检测：
（1）丹参酮含量的检测：在所有转基因根系中，双转SmDXS2-SmGGPPS毛状根丹参酮的平均含量（9.667mg/g DW）相对于对照组提高最多，达15.77倍；SmDXS2根系次之，是对照组的11.7倍；最低的为SmGGPPS根系的平均含量（5.318mg/g DW），是对照组的8.7倍。
（2）丹酚酸含量的检测：结果表明，SmDXS2转基因毛状根的丹酚酸平均含量最高（216.036mg/g DW），是对照的3.52倍；其次为SmGGPPS根系的平均含量（120.074mg/g DW），是对照的1.96倍;含量最低的为SmDXS2-SmGGPPS毛状根的丹酚酸平均含量（48.940mg/g DW）。
（3）转基因拟南芥中次级代谢产物含量的检测：叶绿素和类胡萝卜素含量最高的为双转DXS2-GGPPS拟南芥的叶片（2.362mg/g FW，0.355mg/g FW）；植物激素GA同样在双转DXS2-GGPPS拟南芥的叶片中含量最高（5.943mg/g FW），IAA在转GGPPS基因拟南芥叶片中含量最高（2.752mg/g FW），ABA在所有转基因拟南芥株系中含量均很低。
6.转基因毛状根粗提物抗氧化活性的检测：通过DPPH抗氧化实验的方法进行分析，结果显示，等量的不同种转基因毛状根的粗提物进行对比，转基因根系的抗氧化活性显著高于对照组。
7.转基因毛状根提取物抗肿瘤活性的检测：利用MTT方法作用于NCIH460肺癌细胞，结果显示，不同转基因毛状根提取物的抗肿瘤活性都要强于空对照，其中双转SmDXS2-SmGGPPS抗肿瘤活性最强，SmDXS2其次，活性最差的为SmGGPPS根系。
8.对丹参酮高产的转基因根系诱导后含量及QRT-PCR检测：利用SA和/或SNP诱导子对高产根系GD10进行诱导，结果显示，其中SA在诱导9天时效果最好，含量达36.478mg/g DW；SNP和SA-SNP在诱导6天时效果最好，含量为20.979mg/g DW、34.647mg/g DW。通过QRT-PCR对诱导子处理后的转基因根系进行分析，结果显示，SmDXS2、SmGGPPS的表达量与对应的丹参酮含量趋势相同。
本课题通过将效率较高的上游MEP途径基因与下游途径基因结合提高丹参酮的含量，同时也运用生物诱导子处理丹参酮高产的根系来进一步提高丹参酮的产量。此外，本课题首次在模式植物拟南芥中验证GGPPS和DXS2基因对其他次级代谢产物合成的作用，为进一步研究该基因的功能奠定基础。总的来说，本研究为丹参酮药源问题的缓解提供了新的手段，未来的前景很可观。
本课题采用代谢工程的研究手段，对丹参酮的生物合成途径进行了遗传改造，首次将位于丹参合成途径上游MEP途径中的关键酶基因1-脱氧-D-木酮糖合成酶（1-deoxy-D-xylulose5-phosphate synthase，DXS)基因的其中一个家族成员SmDXS2同位于下游途径中的重要酶基因牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶（Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS）基因共同遗传转化丹参。在农杆菌C58C1的介导下，将含有SmDXS2或/和SmGGPPS的植物表达载体（pCAMBIA1304++SmDXS2/SmGGPPS）在野生丹参的叶片中进行遗传转化，得到不同克隆的转基因丹参毛状根。分析合成途径中一些重要酶基因在PCR鉴定为阳性的转基因毛状根系中的表达情况，并检测阳性毛状根系中丹参酮及其他活性物质（丹酚酸、植物激素类等）的含量，同时通过抗肿瘤活性实验和抗氧化实验对转基因的丹参毛状根当中的丹参酮粗提物的抗癌活性和抗氧化活性进行了验证，进一步显示了关键酶基因SmDXS2和SmGGPPS在丹参酮生物合成中所发挥的作用。为了研究这两种基因对模式植物拟南芥的次级代谢产物的影响，通过农杆菌GV3101对拟南芥进行遗传转化，初步对拟南芥中叶绿素、类胡萝卜素及一些植物激素的含量进行测定。最后，通过添加生物诱导子对筛选后高产的丹参转基因毛状根系进行丹参酮产量进一步的诱导提高，并对相关基因表达情况进行了分析，所取得的实验结果如下：
1.组织表达谱分析：对野生丹参植株的叶片、茎、叶柄、须根和主根中SmDXS2和SmGGPPS基因的表达量进行了相对分析，两者都是在根中的表达量最高，在其他组织当中几乎没有表达。
2.亚细胞定位：在之前研究工作的基础上，完成了植物表达载体pEGAD+SmGGPPS的构建，并将质粒导入农杆菌EHA105中。再通过对烟草进行瞬时转化，发现GFP::GGPPS cDNA融合蛋白定位在细胞膜和细胞核中。
3.丹参和拟南芥的遗传转化及阳性鉴定：运用农杆菌介导法对无菌的丹参叶片和拟南芥的花进行侵染，分别得到了毛状根系：SmDXS2（58个）、SmGGPPS（50个）和SmDXS2-SmGGPPS（60个）；拟南芥株系SmDXS2（54个）、SmGGPPS（54个）和SmDXS2-SmGGPPS（60个）。通过PCR扩增检测，结果分别获得毛状根含有SmDXS2、SmGGPPS和SmDXS2-SmGGPPS阳性克隆11、14、25个，阳性率为18.97%、28.00%和41.67%；拟南芥含有SmDXS2、SmGGPPS和SmDXS2-SmGGPPS阳性克隆14、15、18个，阳性率25.93%、27.78%、30%。
4.转录水平的检测：从MVA途径上游的HMGR基因表达来看，在单转基因GGPPS和DXS2毛状根系中未能促使其表达量增加，而在双转根系中则都有所提高，但提高倍数不多；上游DXS家族中的两个基因DXS1和DXS2表达有所不同，DXS1基因在GD34根系中表达量低，相反DXS2在GD34根系中表达量却很高；单转和双转根系中DXR的表达量都比对照低，下游的GGPPS，在各根系中的表达量都有了很大的变化，其中在单转根系中的表达量相对于对照有了至少6倍的提高，而在双转根系中则提高了17倍，说明转入这两个基因对下游代谢基因起到了一定的调控作用。
5.次级代谢产物含量的检测：
（1）丹参酮含量的检测：在所有转基因根系中，双转SmDXS2-SmGGPPS毛状根丹参酮的平均含量（9.667mg/g DW）相对于对照组提高最多，达15.77倍；SmDXS2根系次之，是对照组的11.7倍；最低的为SmGGPPS根系的平均含量（5.318mg/g DW），是对照组的8.7倍。
（2）丹酚酸含量的检测：结果表明，SmDXS2转基因毛状根的丹酚酸平均含量最高（216.036mg/g DW），是对照的3.52倍；其次为SmGGPPS根系的平均含量（120.074mg/g DW），是对照的1.96倍;含量最低的为SmDXS2-SmGGPPS毛状根的丹酚酸平均含量（48.940mg/g DW）。
（3）转基因拟南芥中次级代谢产物含量的检测：叶绿素和类胡萝卜素含量最高的为双转DXS2-GGPPS拟南芥的叶片（2.362mg/g FW，0.355mg/g FW）；植物激素GA同样在双转DXS2-GGPPS拟南芥的叶片中含量最高（5.943mg/g FW），IAA在转GGPPS基因拟南芥叶片中含量最高（2.752mg/g FW），ABA在所有转基因拟南芥株系中含量均很低。
6.转基因毛状根粗提物抗氧化活性的检测：通过DPPH抗氧化实验的方法进行分析，结果显示，等量的不同种转基因毛状根的粗提物进行对比，转基因根系的抗氧化活性显著高于对照组。
7.转基因毛状根提取物抗肿瘤活性的检测：利用MTT方法作用于NCIH460肺癌细胞，结果显示，不同转基因毛状根提取物的抗肿瘤活性都要强于空对照，其中双转SmDXS2-SmGGPPS抗肿瘤活性最强，SmDXS2其次，活性最差的为SmGGPPS根系。
8.对丹参酮高产的转基因根系诱导后含量及QRT-PCR检测：利用SA和/或SNP诱导子对高产根系GD10进行诱导，结果显示，其中SA在诱导9天时效果最好，含量达36.478mg/g DW；SNP和SA-SNP在诱导6天时效果最好，含量为20.979mg/g DW、34.647mg/g DW。通过QRT-PCR对诱导子处理后的转基因根系进行分析，结果显示，SmDXS2、SmGGPPS的表达量与对应的丹参酮含量趋势相同。
本课题通过将效率较高的上游MEP途径基因与下游途径基因结合提高丹参酮的含量，同时也运用生物诱导子处理丹参酮高产的根系来进一步提高丹参酮的产量。此外，本课题首次在模式植物拟南芥中验证GGPPS和DXS2基因对其他次级代谢产物合成的作用，为进一步研究该基因的功能奠定基础。总的来说，本研究为丹参酮药源问题的缓解提供了新的手段，未来的前景很可观。