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目的:1、探究不同外周血样本预处理方法对所提RNA质量的影响并筛选出较好的预处理方法。在此基础上进一步探究RNA质量是否会受储存时间影响,并评估所用预处理方法在法医学应用中的价值。2、构建在不同组织间具有高保守性并与年龄显著相关的m RNA、mi RNA标记物数据库。方法:1、通过查阅国内外文献,除目前常用的直接冻存法和经过研究验证的TRIzol TM、RNAlater TM和PAXgene RNA采血管储存样本的方法外,另选取了DNA/RNA Shield TM储存样本的方法,因此共有外周血加DNA/RNA Shield TM等八种预处理方法。随后对抽提得到的RNA产量、纯度和完整性方面的差异进行统计学分析。2、外周血加DNA/RNA Shield TM预处理后低温保存,保存时间设置为0天、5天、10天、15天、30天和60天。对所得RNA产量、纯度和完整性方面的差异进行统计学分析。3、筛查外周血和脑组织中与年龄具有显著相关的m RNA和mi RNA标记物。再对不同组织间标记物进行比较分析,筛选出不同组织间随着年龄变化一致的标记物,并构建此类m RNA和mi RNA标记物数据库。结果:1.八种预处理方法均成功提取RNA。外周血加DNA/RNA Shield TM方法所提RNA纯度为1.837±0.020,产量为3.035±0.298μg/m L,RIN为8.467±0.038。外周血加TRIzol TM方法RNA纯度为1.893±0.030,产量为1.977±0.085μg/m L,RIN为8.167±0.195。外周血加RNAlater TM方法RNA纯度为1.863±0.150,产量为2.251±0.172μg/m L,RIN为8.033±0.158。血细胞加DNA/RNA Shield TM方法RNA纯度为1.900±0.011,产量为3.847±0.170μg/m L,RIN为8.200±0.129。白细胞加TRIzol TM方法RNA纯度为1.814±0.016,产量为2.468±0.060μg/m L,RIN为8.200±0.120。白细胞加RNAlater TM方法RNA纯度为1.621±0.046,产量为2.468±0.060μg/m L,RIN为8.133±0.135。外周血直接冻存方法RNA纯度为1.125±0.044,产量为1.728±0.287μg/m L,RIN为5.583±0.132。PAXgene Blood RNA Tube方法RNA纯度为2.030±0.002,产量为2.457±0.123μg/m L,RIN为9.433±0.154。经配对t检验对八种预处理方法所得RNA的质量进行组间差异比较分析。RNA纯度方面,白细胞加RNAlaterTM方法和直接冻存方法最差,其余六种方法纯度较好且无统计学差异。RNA产量方面,血细胞加DNA/RNA ShieldTM方法产量最高,外周血加TRIzolTM组、白细胞加RNAlaterTM组和直接冻存组产量相对较低,其中直接冻存组与其余五组间差异有统计学意义。RNA完整性方面,PAXgene Blood RNA Tube方法最好,直接冻存方法最差。除保存液为DNA/RNA ShieldTM的2个方法外,均与PAXgene Blood RNA Tube方法存在统计学差异。2、六个储存时长RNA纯度均在1.815-1.952之间,随储存时间延长,RNA产量从4.516下降至1.039,RNA完整性在由8.533下降至7.150。经单因素方差分析对六个储存时长所得的RNA产量、纯度及完整性进行统计学分析后发现,随着RNA储存时间的延长,RNA的产量和完整性均下降且存在统计学意义。3、经过对年龄相关数据的分析及处理,在外周血中筛选出2194个与年龄相关的m RNA标记物和319个与年龄相关的mi RNA标记物,在脑组织中筛选出556个与年龄相关的m RNA标记物和127个与年龄相关的mi RNA标记物。通过不同组织间的比较分析,最终构建了包含320个m RNAs和28个mi RNAs的年龄相关标记物数据库。结论:1、经过对本研究中八种预处理方法所得RNA在纯度、产量和完整性方面差异的分析,推荐外周血加DNA/RNA ShieldTM的方法作为外地采样时样本的预处理方法,其质量也能满足高通量测序等实验对RNA质量的要求。2、经过外周血加DNA/RNA ShieldTM处理的样本在低温条件下最多可存放60天,其质量可满足高通量测序等下游实验的要求。3、通过不同组织的比较分析,共筛选并构建出包含320个m RNA和28个mi RNA的标记物数据库,这些RNA标记物同时具有与年龄高度相关并在组织间高度保守的特性,体现出了RNA在法医学年龄推断方面具有潜在的应用价值。