论文部分内容阅读
采后果实的软化速度是影响保质期与货架寿命的关键,搞清楚其内部调控机制是创建采后保鲜新途径的基础和依据。脂氧合酶(LOX)不仅在果实质地软化和成熟衰老过程中扮演着重要角色,其参与合成的茉莉酸(JA)也与乙烯和果实的成熟衰老有关。近年来,已经有越来越多的研究围绕其展开。柿和苹果均属呼吸跃变型果实,在消费市场上深受广大消费者的喜爱,目前尚未见到柿果实LOX基因序列的报道,在这两种果实上也没有LOX基因家族成员的系统研究。本论文以‘富平尖柿’和‘金冠’的果实为材料,围绕LOX与它们成熟衰老的关系进行研究,主要结果如下:1.运用RACE技术,从柿果实成功克隆到两个LOX基因的cDNA序列,DkLOX1(基因登录号为JF436951)和DkLOX3(基因登录号为JF436950),系统进化树分析表明它们均属9-LOX型。构建了一个原核表达载体pET-DkLOX1,SDS-PAGE凝胶电泳后,该载体表达出1条接近118kDa的特异蛋白条带。2.用60mg L–1的GA3溶液和50mg L–1的ABA溶液处理采后柿果实,常温(20~24℃)贮藏期间定期取样进行相关生理指标的测定,结果表明,与对照相比,GA3处理使果实保持了较高的硬度,较低的丙二醛(MDA)含量,乙烯释放高峰值和LOX活性降低,减缓了果实的成熟软化与衰老进程;而ABA处理则促进果实硬度下降和MDA含量上升,乙烯释放高峰和LOX活性高峰均被提前了3d,加速了这一进程。3.运用实时荧光定量PCR(QPCR)技术检测柿果实在GA3和ABA处理后常温(20~24℃)贮藏期间DkLOX1和DkLOX3表达水平的变化,结果表明,DkLOX1和DkLOX3的表达变化趋势与LOX活性以及乙烯释放量的变化趋势一致。具体表现为,GA3处理使DkLOX1和DkLOX3的表达水平降低,二者的表达高峰时间均与对照一致,出现在采后贮藏第15d;而ABA处理后这两个基因的表达均被上调,表达高峰提前了3d,其中DkLOX3对这两种处理反应更为敏感。4.以‘金冠’果实为试材,在商业采收前12周(07/17到10/02)进行相关生理指标的测定,发现果实硬度不断下降,直径不断上升,淀粉指数(SPI)在后期明显上升,内源乙烯仅在最后几周被明显检测到且浓度很低。运用常规PCR和QPCR技术对这期间果实中表达的13-LOX家族成员及其他与JA合成途径相关的基因进行筛选,确定了在果肉(含果皮)和果心中表达的13个基因,包括:4个LOX(MdLOX22、MdLOX23、MdLOX28和MdLOX39),3个AOS(MdAOS2、MdAOS3和MdAOS5),2个AOC(MdAOC2和MdAOC5),2个JMT(MdJMT2和MdJMT5)以及2个ERF(MdERF1和MdERF2)。5.以商业采收前12周的‘金冠’果实为试材,运用QPCR技术对上述13个基因以及乙烯合成酶基因MdACS3的表达模式进行检测,发现它们的转录本在果肉(含果皮)中呈现4种变化模式:Ⅰ“前期高”,有3个,包括:MdLOX28、MdAOC2和MdAOC5;Ⅱ“后期高”,一共7个,这些基因是:MdLOX22、MdLOX23、MdAOS2、MdERF1、MdERF2、MdJMT2和MdACS3;Ⅲ:“整体变化不明显”,有2个,包括:MdAOS3和MdJMT5;Ⅳ“一直下降”,有2个,它们是:MdLOX39与MdAOS5。MdLOX23和MdAOS2在果肉(含果皮)和果心部位有一致的表达趋势,表达量都在10/02显著增加。6.对商业采收前SPI达1.2、1.9和3.5的‘金冠’果实进行MeJA溶液喷洒处理,定期采样进行相关生理指标的测定,结果表明,除了极个别采样点外,处理果和对照果之间的硬度和SPI整体差异不明显,但对内源乙烯的产生有影响,表现为:在SPI=1.2处理的果实,内源乙烯浓度从09/18开始明显上升,且在最后一次采样时达到高峰;在SPI=1.9处理的果实,内源乙烯浓度在处理后不断上升,在09/18达到高峰而后降低;而在SPI=3.5处理的果实,内源乙烯浓度在采样前期上升而后期降低。7.以SPI达1.2、1.9和3.5时外源MeJA处理后的‘金冠’果肉(含果皮)为试材,运用QPCR技术对LOX和AOS家族成员的相对表达量进行检测,发现SPI=1.2时外源MeJA处理后,除了MdLOX39与MdAOS2,其他基因的表达量在处理后第1d上调;在SPI=1.9时外源MeJA处理后,除了MdAOS2,其他基因的表达量也在处理后第1d上调,其中MdLOX22、MdLOX23和MdLOX28的表达量在整个采样期间均高于对照;在SPI=3.5时外源MeJA处理后,除了MdAOS2与MdAOS3,其他基因的表达量均在处理后第1d明显上调,并且在整个采样期间高于对照。