甘肃玉米镰孢菌茎腐病病原菌多样性及抗性基因挖掘

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 6次 | 上传用户:war_and
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玉米(Zea mays L)不仅是我国重要的粮饲兼用型作物,也是重要的能源植物和工业原料,在国民经济中占有重要的地位。气候变化、品种更替以及耕作制度改变,玉米茎腐病的发生和为害呈明显加重趋势;随着机械化收获和籽粒直收,茎腐病已成为一个亟待解决的问题。因此本研究调查了甘肃不同生态区玉米茎腐病的发生和为害情况,并采集样本,从病原种类、优势病原的遗传多样性、产毒类型和抗性基因挖掘等方面进行了研究,主要包括以下几个方面:(1)于2015年和2017年分别对甘肃玉米茎腐病的分布范围和为害程度进行了系统调查,结果显示,该病害在华亭县、庄浪县、灵台县、崆峒区、泾川县、华池县、镇原县、合水县、庆城县、宁县、清水县、秦州区、秦安县、甘谷县、麦积区、张家川县、成县、迭部县、康县、舟曲县、临夏县、广河县、平川区、靖远县、会宁县、通渭县、安定区、临洮县、甘州区、高台县、临泽县、肃州区和凉州区均有分布,且2年的平均病田率和分别为28.6%和100%,病株率分别为3.6%和31.5%。(2)为了明确甘肃玉米镰孢茎腐病的病原种类和致病类群,在甘肃省四大生态区(陇南地区、陇东地区、陇中地区和河西走廊)采集玉米茎腐病样品42份,以组织分离法进行病原物的分离培养,对分离得到的镰孢菌菌落进行纯化和单孢分离后,以形态学特征为依据,结合培养性状,参照Leisle分类系统进行鉴定。试验结果显示:共分离到253株镰孢菌菌株,其中禾谷镰孢菌复合种(Fusarium graminearum species complex,FGSC)150株、拟轮枝镰孢(F.verticillioides)29株、木贼镰孢(F.equiseti)26株、胶孢镰孢(F.subglutinans)15株、层出镰孢(F.proliferatum)12株、变红镰孢(F.incarnatum)10株、三线镰孢(F.tricinctum)5株、温带镰孢(F.temperatum)3株、锐顶镰孢(F.acuminatum)2株、尖孢镰孢(F.oxysporum)1株,其分离频率依次为59.3%、11.5%、10.3%、5.9%、4.7%、4.0%、1.9%、1.2%、0.8%和0.4%。按照柯赫氏法则对玉米品种甘宇2号通过平皿法测定、盆栽法测定和田间试验进行致病性测定,其中平皿法测定和盆栽法测定证实了10种镰孢菌均为致病菌,其中禾谷镰孢复合种和拟轮枝镰孢为甘肃玉米茎腐病的优势病原。而木贼镰孢、胶孢镰孢、层出镰孢、变红镰孢、三线镰孢、温带镰孢、锐顶镰孢和尖孢镰孢作为玉米茎腐病的病原菌首次在甘肃报道。(3)选取代表性菌株HCSZ4-9、HHXHZ15-7、ZY2-2、PC14-1、YJ8-1、ZY7-1、ZY11-1、KTQ3-1、ZQDC13-3、HA26、TW30、ZY13-2、KTQ16、KTQ19、ZJCZC14-5、ZJCZC14-2、TW26、TW40和HCSZ4-19进行EF-1α(tef)基因序列分析,将PCR产物回收测序后在GenBank上比对,发现菌株HHXHZ15-7与布斯镰孢(F.boothii);菌株HCSZ4-9与禾谷镰孢;菌株ZY2-2和PC-14-1与拟轮枝镰孢(F.verticillioides);菌株YJ8-1和ZY 7-1与木贼镰孢;菌株ZY 11-1和KTQ3-1与胶孢镰孢;菌株ZQDC13-3和HA-26与层出镰孢;菌株TW 30和ZY 13-2与变红镰孢;菌株KTQ16和KTQ19与三线镰孢;菌株ZJCZC14-5和ZJCZC14-2与温带镰孢;菌株TW26和TW40与锐顶镰孢;菌株HCSZ4-19与尖孢镰孢分别位于系统发育树的同一分支,说明分子鉴定结果与形态学鉴定结果相吻合。(4)利用镰孢菌特异性引物对禾谷镰孢复合种150个菌株进行种间鉴定,共检测出110株布斯镰孢和40株禾谷镰孢,本研究掌握了甘肃玉米镰孢茎腐病禾谷镰孢复合种的种群结构由布斯镰孢和禾谷镰孢2个类群组成,分别占73.33%和24.67%,其比例约为3:1。(5)为明确甘肃省玉米镰孢茎腐病病菌地理种群的遗传多样性,本研究应用8对VNTR和10对SSR引物对甘肃省4大生态区玉米茎腐病优势病原禾谷镰孢复合种群体的遗传多样性进行了研究,试验结果表明,18对引物在114株禾谷镰孢复合种中共检测到等位位点数26个,多态性位点数26个,多态性条带百分率为100%。4个地理种群平均等位基因数为1.9519,有效等位基因数为1.7140,Nei’s基因多样性指数为0.3939,Shannon信息指数为0.5691,多态性位点数为24.75,多态位点百分率为95.19%。4个地理种群的Nei’s遗传相似度为0.88800.9674,遗传距离为0.03310.1188。禾谷镰孢复合种地理种群聚为3个大类群,陇南地区为第Ⅰ类群,河西地区为第II类群,陇东地区和陇中地区为第Ⅲ类群。禾谷镰孢复合种的种群遗传变异主要来自种群内部,占总变异的90.71%。(6)经对114株禾谷镰孢复合种产毒化学型检测,发现42株产生15-AcDON,34株产生3-AcDON,20株产生NIV,18株不产毒,分别占36.84%、29.82%、17.54和15.79%。研究结果同时表明,布斯镰孢和禾谷镰孢均能产生15-AcDON、3-AcDON和NIV,3种毒素在4个生态区均有分布。(7)为了解短密木霉(Trichoderma brevicompactum)对植物病害的生防作用及其生物学特性,利用稀释平板分离法从甘肃省景泰县马铃薯连作田植株根际土壤中分离到1株木霉菌株GAS1-1,经形态观察、rDNA-ITS和EF-1α序列分析明确其分类地位;用生物学方法研究明确该菌的营养生长和产孢条件要求;采用对峙培养法测定该菌株对5种植物病原真菌的抑制作用。形态学特征和基因序列分析结果表明,菌株GAS1-1为短密木霉(T.brevicompactum),为甘肃省木霉新记录种。该菌株对禾谷镰孢、拟轮枝镰孢、尖孢镰孢、肿囊腐霉(Pythium inflatum)和灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)均具有较好的拮抗效果,尤其对肿囊腐霉抑制作用最好,抑菌率达100%。生物学特性研究结果表明,该菌株营养生长和产孢的最适碳源和氮源分别为葡萄糖和酵母膏;其在1535℃均可生长,最适菌丝生长温度为30℃,最佳产孢温度为25℃;在pH 5.012.0的培养基上菌丝均可生长,最适菌丝生长和产孢的pH值均为5.0;24 h黑暗条件下菌丝营养生长最快,12 h光暗交替条件有利于产孢;孢子致死温度为69℃,10 min。说明短密木霉菌株GAS1-1具有较好的生防应用潜力。(8)采用高抗禾谷镰孢茎腐病自交系X178和高感自交系B73进行杂交构建F2群体,并对该群体在大喇叭口期进行人工接种抗病性鉴定,明确其表型性状,调查结果表明,抗感比例约为2.38:1。根据表型结果对50个抗病和50个感病材料,及2个亲本分别建库,进行WGS全基因组重测序,通过BSA性状定位分析,基于SNP-index和InDel-index鉴定出的候选基因分别为6个和33个,通过整合SNP和InDel信息,发现6号染色体上Zm00001d035153发生了非同义突变,3号染色体Zm00001d040332发生了移码突变,即这2个基因在编码区蛋白质的序列发生了改变,因此,我们推断Zm00001d035153和Zm00001d040332为2个主要抗病候选基因。该研究结果将为玉米抗禾谷镰孢茎腐病育种提供可利用的抗病基因和有效的基因资源,以及用于快速辅助选择的功能标记,提高抗禾谷镰孢茎腐病的育种速度和效率,构建玉米抗禾谷镰孢茎腐病分子育种技术体系。
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