论文部分内容阅读
肺癌是当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一，发病率在多数国家仍呈升高趋势。目前，肺癌的主要治疗方法是以外科手术为主的多学科综合治疗，包括放疗、化疗及生物治疗等，但治疗效果在近十年来没有显著的提高，总的治愈率在10-15％左右，多数病人仍死于术后的复发、转移。因此，既能提高机体免疫力，又能杀伤肿瘤细胞的主动免疫治疗已成为目前肺癌治疗的一个重要研究方向。但在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤中都存在“免疫逃逸”现象。现有的研究表明：肿瘤细胞抗原性弱只是造成肿瘤“免疫逃逸”的部分原因；而更为重要的原因是患者体内的细胞免疫功能异常。肿瘤的细胞免疫有赖于抗原递呈细胞(APC，AntigenPresenting)将肿瘤抗原递呈给T淋巴细胞等免疫效应细胞，发挥抗肿瘤效应。树突状细胞(DendriticCell，DC)则是体内功能最强的APC。然而，在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤中，由于肿瘤细胞常分泌如TGFβ等免疫抑制因子，使得DC处于一种“未成熟”状态，不能有效的识别、加工和处理抗原，从而导致了DC对肿瘤细胞的一种“失能”状态。因此，如何做到既能增强肿瘤细胞的抗原性，又能改变免疫细胞的“失能”状态是目前肿瘤疫苗研究的一个新思路。本研究应用细菌内同源重组法构建含有Smad7cDNA的重组腺病毒载体；应用Smad7基因修饰联合3LL-pcDNA3-K-ras/V12细胞株的细胞抗原体外致敏而获得新型的DC疫苗，以研究该疫苗在体内外的抗肺癌作用和其机制。本研究观察到：
1、利用CaCl2转化法先将pAdEasy-1转入BJ5183，再将Pmel线性化的穿梭质粒pAdTrackCMV-Smad7转入BJAdEasy-1进行重组，1-2天左右即可获得30％左右的阳性重组质粒细菌克隆。
2、DNA测序和PCR检测证明重组腺病毒Ad-Smad7中已含有目的基因Smad7。
3、重组腺病毒Ad-Smad7在293细胞中包装后可获得滴度达109pfu/ml的病毒液。当MOI=100时，重组腺病毒Ad-Smad7感染树突状细胞的有效率达70％。
4、PCR结果显示DC-Smad7细胞与DC-K-ras/V12细胞已分别转染进了Smad7基因和突变的K-ras基因。
5、体外应用rmGM-CSF和rmIL-4可以从C57BL/6小鼠骨髓细胞诱导出成熟的DC，经体外抗原致敏后(DC-control+Ag)可高表达表面粘附分子CD11c(63.4％)、MHC-Ⅱ(78.9％)、CD80(80.3％)、CD86(60.8％)、CD40(78.1％)、CD54(73.9％)。
6、在有外源性TGFβ1存在的条件下，体外抗原致敏后的DC细胞(即DC+TGFβ1+Ag组)表面粘附分子CD11c(25.1％)、MHC-Ⅱ(36.8％)、CD86(24.1％)、CD80(37.2％)、CD40(26.5％)、CD54(55.1％)的表达水平均显著低于DC-control+Ag组(p＜0.01)。
7、向DC内转入Smad7基因并抗原致敏后，在存在外源性TGFβ1的情况下，转基因DC仍能高表达成熟相关粘附分子，与空载体组比较有显著性差异(p＜0.01)。
8、在存在外源性TGFβ1的情况下，Smad7基因修饰联合肺癌抗原致敏的DC仍能诱导淋巴细胞的增殖反应，且显著强于空载体组(p＜0.01)。
9、在存在外源性TGFβ1的情况下，Smad7基因修饰联合肺癌抗原致敏的DC疫苗免疫小鼠，诱导的脾脏淋巴细胞CTL活性显著高于空载体组(p＜0.05)。
10、体内实验观察到Smad7基因修饰联合肺癌抗原致敏DC组3LL-pcDNA3-K-ras/V12肺癌移植瘤的生长均明显延缓，肿瘤体积、瘤重均显著低于对照组、DC-Ad-c组和DC-K-ras组(P＜0.01)，抑瘤率则显著高于对照组、DC-Ad-c组和DC-K-ras组(P＜0.01)。
11、Smad7基因修饰联合肺癌抗原致敏DC组3LL-pcDNA3-K-ras/V12肺癌移植瘤肺转移率(30％)显著低于对照组(90％)和DC-Ad-c组(80％)(P＜0.01)；与突变K-ras基因修饰的DC疫苗组肺转移率(30％)相同。
12、Smad7基因修饰联合肺癌抗原致敏DC组3LL-pcDNA3-K-ras/V12肺癌移植瘤肺部转移瘤瘤灶数量显著少于对照组和DC-Ad-c组(P＜0.01)，其肺部转移瘤瘤灶少于突变K-ras基因修饰的DC疫苗组，但无统计学差异(P＞0.05)。
结论：(1)改良细菌内同源重组法构建的重组腺病毒Ad-Smad7能有效介导Smad7基因转染，具有实验周期短、简便易行、滴度高、成功率高等优点。(2)Smad7基因修饰/抗原致敏的DC疫苗能有效诱导机体产生特异性的抗肿瘤免疫反应，抑制表达突变K-ras基因的3LL-pcDNA3-K-ras/V12肺癌细胞株体内的生长和远处转移；且抑制肿瘤生长的作用强于突变K-ras基因修饰的DC疫苗。(3)Smad7基因修饰/抗原致敏的DC疫苗为肺癌的免疫治疗提供新的思路和途径。