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成肌细胞具有多种分化潜能,除了可以定向分化为肌纤维外,还可以被诱导进入成脂分化。成肌细胞进行成脂分化,在肌肉组织中异位沉积脂肪形成肌内脂肪,通常与机体代谢紊乱综合症的发生有关。近年来研究发现具有棕色脂肪代谢活性的细胞零散分布于肌内脂肪中,其数量与机体的抗肥胖能力显著相关。因此研究成肌细胞向棕色脂肪细胞分化的分子机理对机体健康具有积极意义。棕色脂肪特异性因子PRDM16(Positive Regulatory Domain zinc finger protein16),又称PRDI-BF1-RIZ1(Positive Regulatory Domain I-Binding Factor1and Retinoblastoma-Interacting Zinc finger factor-1)通常被认为是决定肌肉和棕色脂肪细胞共同的前体细胞(中胚层Myf5+/+前体细胞)肌肉/棕色脂肪细胞分化的“开关”。异位表达PRDM16的成肌细胞成肌分化受到抑制,在生脂培养基中可以被诱导分化为棕色脂肪细胞,但目前PRDM16抑制成肌分化,促进棕色脂肪分化的转录调控机制尚不明了。1PRDM16对生肌／生脂因子转录及其启动子／增强子DNA甲基化的影响DNA甲基化是细胞分化过程中调控组织特异性基因转录的重要机制之一,因此本实验通过携带Flag-PRDM16的鼠干细胞病毒(Murine Stem Cell Virus, MSCV)转导增殖期的C2C12成肌细胞,抗性筛选稳定克隆,通过SEQUENOM检测了肌肉特异性碱性螺旋-环-螺旋(basic Helix-Loop-Helix, bHLH)转录因子家族生肌调节因子(Myogenic Regulatory Factors, MRFs)和生脂因子过氧化物酶体增殖激活受体Y(Peroxisome Proliferator Activating Receptor-γ, PPARy)启动子和/或增强子区域DNA甲基化程度的改变。结果表明,稳定表达PRDM16对C2C12成肌细胞的增殖能力没有显著影响,显著降低了C2C12分化为肌管的能力,表现为在生肌培养基(含2%马血清)中孵育4天,肌管的标志分子肌球蛋白重链(Myosin Heavy Chain, MyHC)、肌肉型肌酸激酶(Muscle-type Creatine Kinase, MCK)以及MRFs(MyoD, Myf5, myogenin, MRF4) mRNA的表达量显著降低(P<0.05),表明转导的外源PRDM16是具有生物功能的,有效抑制了C2C12细胞的成肌分化。为了避免生肌/生脂培养基对生肌／生脂因子转录的干扰,我们采用自然分化培养基(即正常的生长培养基,含10%FBS)诱导细胞分化。4天后,稳定表达PRDM16的C2C12细胞内甘油三酯(triglyceride, TG)勺沉积升高了近一倍(P<0.05),同时生脂因子PPARy、CCAAT/增强子结合蛋白-α (CCAAT/Enhancer Binding Protein-a, C/EBPa)的转录水平显著升高(P<0.05)。PRDM16同样降低了自然分化条件下C2C12融合成肌管的能力,生肌因子MRFs及MyHC的表达显著下降(P<0.05)。结果表明PRDM16抑制C2C12细胞成肌分化,促进成脂分化,并且PRDM16改变C2C12的分化方向主要是通过改变生肌／生脂因子的转录水平实现的。在未分化的C2C12成肌细胞中,PRDM16显著降低了除MyoD以外的其他生肌因子的转录水平,PPARy mRNA的表达显著升高(P<0.05),提示PRDM16削弱了C2C12向肌纤维分化的潜力,增强了其向脂肪分化的潜能,使C2C12成肌细胞具有了“棕色前体细胞”的某些潜质。对基因组DNA进行亚硫酸盐处理,通过SEQUENOM检测以上生肌因子及PPARy启动子和／或增强子区域的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)甲基化水平。结果显示转导PRDM16显著增高了MyoD核心增强子、第一外显子区域以及myogenin启动子DNA的甲基化程度,降低了Myf5最小启动子区域部分CpG位点的甲基化水平。而MRF4、PPARy启动子DNA甲基化没有显著改变。2PR结构域缺失对PRDM16生物功能的影响PR结构域(Positive Regulatory domain)是PRDM蛋白家族的特征性结构之一,PR结构域对PRDM16调控生肌/生脂因子转录的影响目前尚未见报道。为了分析PR结构域的功能,我们进一步构建了PR结构域缺失(PRDM16-APR)的质粒,筛选稳定克隆,研究PR结构域缺失对PRDM16生物功能的影响。与野生型PRDM16相比,PRDM16-APR削弱C2C12生肌能力的作用更加明显,表现为肌纤维标志性分子MyHC、MCK的表达显著下降(P<0.05),同时MyoD的表达显著下降(P<0.05)。PRDM16-APR显著削弱了PRDM16升高细胞内TG以及激活PPARy转录的作用(P<0.05)。MyoD和PPARy转录被PRDM16-APR抑制,伴随启动子区域组蛋白修饰的改变。染色质免疫沉淀分析(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)显示,PRDM16-APR显著升高了MyoD的启动子区域H3乙酰化、H3K9me3和H3K27me3的富集程度(P<0.05)；PRDM16-APR显著降低了PPARy启动子部位H3乙酰化、H3K4me3和H3K27me3的富集程度,显著升高了H3K9me3的富集程度(P<0.05)。以上结果提示,PR结构域参与了PRDM16MyoD、PPARy的转录调节,但PR结构域的作用途径仍有待进一步的研究。