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第一部分：体外诱导间充质干细胞向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化
目的:探索体外诱导小鼠骨髓来源间充质干细胞(mice bore marrow derived mesenchymalstem cells，mMSCs)分化为Ⅱ型肺泡上皮(ATⅡ)细胞的有效方法。
方法:原代分离C57BL/6小鼠骨髓MSCs，并进行表面标志物流式细胞学检测和成脂、成骨、成软骨诱导分化以对其进行鉴定。将纯化后的mMSCs分为以下四组:空白对照组、小气道培养基(small airway growth medium,SAGM)诱导分化组、小鼠肺上皮细胞(murine lung epithelial，MLE-12细胞)共培养诱导分化组和共培养结合SAGM诱导分化组。处理后的mMSCs光镜和电镜下观察形态结构变化、提取蛋白和mRNA，western blotting法和realtime PCR检测Ⅱ型肺泡上皮细胞标志表面活性蛋白(surfactant protein,SP)C、SPB、SPD及Ⅰ型肺泡上皮细胞标志水通道蛋白(aquaporin,AQP)5水平以评估mMSCs向肺泡上皮细胞的分化。
结果:(1)分离纯化后的mMSCS为成纤维样，经鉴定表达CD34、CD44、CD29、SCA-1，不表达CD117，且可体外诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞。(2)光镜下诱导分化的mMSCs部分形态由成纤维样变为铺路石样的似上皮细胞样结构，电镜检查也在共培养结合SAGM诱导的mMSCs中发现了少量Ⅱ型肺泡上皮细胞特征性的板层小体。(3)SAGM、MLE-12共培养和共培养结合SAGM均可诱导mMSCs的pro-SPC蛋白和SPC、SPB、SPD的mRNA水平上调，而共培养结合SAGM诱导较前两者能诱导更明显的上调上述蛋白和mRNA。
结论:(1)本研究原代分离的小鼠骨髓单个核细胞确系间充质干细胞。(2)SAGM、MLE-12共培养和SAGM结合共培养方式均可一定程度上诱导mMSCs向Ⅱ型肺泡上皮细胞的分化，但共培养结合SAGM的方式能更明显的促进mMSCs向Ⅱ型肺泡上皮细胞的分化，而该方法也被用于本研究的第二部分。
第二部分：经典Wnt通路对小鼠骨髓间充质干细胞向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化的调节作用
目的:明确经典Wnt通路在小鼠mMSCs向ATⅡ细胞分化过程中的作用。
方法:在MLE-12细胞共培养结合SAGM体外诱导mMSCs分化为ATⅡ细胞的基础上，分别加入经典Wnt通路激活剂LiC1、Wnt3a或抑制剂DKK-1调节mMSCs经典Wnt信号。干预后提取mMSCs的蛋白和mRNA，Western blotting检测经典Wnt通路相关信号分子GSK3β和β-catenin及Ⅱ型肺泡上皮细胞特异性蛋白pro-SPC的表达，realtimePCR检测SPC、SPB、SPD和AQP5mRNA水平，以评价经典Wnt途径对mMSCs向ATⅡ细胞分化的作用。
结果:(1)LiCI4mmol/L或Wnt3a150ng/ml能明显上调普通培养条件下和诱导分化条件下的mMSCs中磷酸化GSK3β和β-catenin的表达，而DKK-1200ng/ml则下调以上两种蛋白的表达。(2)分化过程中mMSCs的经典Wnt通路相关蛋白磷酸化GSK3β和β-catenin水平上调。(3)LiC1或Wnt3a干预能上调pro-SPC蛋白、SPC、SPB或SPDmRNA的水平，而DKK-1干预使pro-SPC蛋白和SPC、SPDmRNA减少。
结论:(1)mMSCs向ATⅡ细胞分化过程中，经典Wnt途径活性增加。(2)激活经典Wnt途径能促进mMSCs向ATⅡ细胞的分化。