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目的:观察泛素连接酶RING2对苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,B(a)P]导致的人肺来源细胞(16HBE、BEAS-2B、VA13)BPDE-DNA加合物变化及ATR-CHK1-CDC25A-CDK2信号通路中相关蛋白表达及磷酸化水平的影响,初步探讨组蛋白单泛素化关键酶RING2在DNA损伤应答中的作用。方法:通过SiRNA技术降低肺来源细胞中泛素连接酶RING2的表达水平,构建RING2低表达细胞模型。用不同浓度的BaP(0、1、2、4、8、16、32μmol/L)染毒三种肺来源细胞的三型细胞(WT、Si-NC、Si-RING2)24 h,以16μmol/L BaP染毒三种肺来源细胞的三型细胞不同时间(0、1、2、4、8、12、24 h)。使用免疫组化荧光法检测各组细胞中BPDE-DNA加合物的表达情况,采用蛋白免疫印迹法检测细胞总蛋白中共济失调-毛细血管扩张有关激酶(Ataxia telangiectasi and Rad3 related,ATR)、细胞周期检测点激酶1(Checkpoint kinase 1,CHK1)及其Ser345-p、CDC25A(cell division cycle 25 homolog A,细胞分裂周期蛋白25A)及其S76-p、周期素依赖性蛋白激酶2(Cyclin dependent kinase 2,CDK2)及其Y15-p的表达水平。结果:免疫组化荧光检测结果显示,与三种肺源性细胞的WT型对照组相比,各细胞型(WT、Si-NC、Si-RING2)染毒组的荧光强度均增加(P<0.01),其中三种肺源性细胞的Si-RING2型染毒组的荧光强度最强。16μmol/L B(a)P染毒24 h处理组中,16HBE(Si-RING2)染毒组的荧光强度较16HBE(WT)染毒组增加了41.3%,差异有统计学意义(P<0.01);BEAS-2B(Si-RING2)染毒组的荧光强度较BEAS-2B(WT)染毒组增加了31.7%,差异有统计学意义(p<0.01);va13(si-ring2)染毒组的荧光强度较va13(wt)染毒组增加了51.4%,差异有统计学意义(p<0.01)。蛋白免疫印迹法结果显示,随着染毒时间和染毒浓度的增加,三种肺源性细胞wt型的atr,chk1、chk1s345-p、cdc25as76-p和cdk2y15-p的水平逐渐升高,而cdc25a和cdk2的水平逐渐下降(p<0.01);三种肺源性细胞si-ring2型的atr、chk1、chk1s345-p、cdc25as76-p和cdk2y15-p的水平逐渐下降,而cdc25a和cdk2的水平逐渐升高(p<0.01)。(1)、协方差分析控制染毒浓度因素后,16hbe(si-ring2)组atr、chk1、chk1s345-p、cdc25as76-p和cdk2y15-p水平的修正均数(0.804、0.823、0.756、0.728和0.834)较16hbe(wt)组的修正均数(1.473、1.311、1.375、1.387和1.331)明显降低,16hbe(si-ring2)组cdc25a和cdk2水平的修正均数(1.324和1.293)较16hbe(wt)组的修正均数(0.803和0.767)明显升高(p<0.01));beas-2b(si-ring2)组atr、chk1、chk1s345-p、cdc25as76-p和cdk2y15-p水平的修正均数(0.775、0.831、0.726、0.800和0.677)较beas-2b(wt)组的修正均数(1.356、1.334、1.429、1.366和1.270)明显降低,beas-2b(si-ring2)组cdc25a和cdk2水平的修正均数(1.369和1.395)较beas-2b(wt)组的修正均数(0.775和0.811)明显升高(p<0.01);va13(si-ring2)组atr、chk1、chk1s345-p、cdc25as76-p和cdk2y15-p水平的修正均数(0.831、0.863、0.837、0.666和0.838)较va13(wt)组的修正均数(1.322、1.343、1.392、1.450和1.506)明显降低,va13(si-ring2)组cdc25a和cdk2水平的修正均数(1.325和1.324)较va13(wt)组的修正均数(0.830和0.793)明显升高(p<0.01)。(2)、协方差分析控制染毒时间因素后,16hbe(si-ring2)组atr、chk1、chk1s345-p、cdc25as76-p和cdk2y15-p水平的修正均数(0.836、0.751、0.726、0.808和0.796)较16hbe(wt)组的修正均数(1.264、1.309、1.324、1.389和1.430)明显降低,16hbe(si-ring2)组cdc25a和cdk2水平的修正均数(1.255和1.396)较16hbe(wt)组的修正均数(0.791和0.781)明显升高(p<0.01);beas-2b(si-ring2)组atr、chk1、chk1s345-p、cdc25as76-p和cdk2y15-p水平的修正均数(0.715、0.736、0.782、0.800和0.807)较beas-2b(wt)组的修正均数(1.316、1.342、1.536、1.373和1.302)明显降低,beas-2b(si-ring2)组cdc25a和cdk2水平的修正均数(1.323和1.233)较beas-2b(wt)组的修正均数(0.776和0.743)明显升高(p<0.01);VA13(Si-RING2)组ATR、CHK1、CHK1 S345-p、CDC25A S76-p和CDK2 Y15-p水平的修正均数(0.744、0.817、0.784、0.743和0.820)较VA13(WT)组的修正均数(1.399、1.447、1.351、1.369和1.291)明显降低,VA13(Si-RING2)组CDC25A和CDK2水平的修正均数(1.369和1.315)较VA13(WT)组的修正均数(0.819和0.835)明显升高(P<0.01)。结论:1、B(a)P会导致细胞内BPED-DNA加合物增加,RING2低表达的细胞DNA对B(a)P更加敏感,这提示RING2可能会影响DNA的损伤修复;2、B(a)P会导致DNA损伤应答通路ATR-CHK1-CDC25A-CDK2的激活,暴露于B(a)P中的RING2低表达的细胞内该通路被抑制。以上结论提示泛素连接酶RING2可能会通过影响DNA损伤应答通路ATR-CHK1-CDC25A-CDK2的活性来影响受损DNA的修复。