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胶质瘤作为中枢神经系统最常见原发性肿瘤,约占中枢神经系统原发性肿瘤的70%,依据WHO分类胶质瘤可分为四个级别,其中Ⅰ/Ⅱ级为低级别胶质瘤,Ⅲ/Ⅳ级为高级别胶质瘤。多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiform,GBM)作为胶质瘤中恶性程度最高的Ⅳ级肿瘤,患者预后极差,尽管美国癌症医学网络(NCCN)推荐术后放疗联合同步和辅助替莫唑胺(Temozolomid,TMZ)化疗(Stupp方案)作为治疗GBM的标准方案,但也仅提高患者2个月的总体生存期。研究表明TMZ是以诱导细胞自噬的方式,针对GBM发挥化疗作用。我们前期研究证实:TMZ作用下,部分自噬细胞短期存活,并伴随EMT发生,促进存活细胞迁移和侵袭,介导放化疗抗性。本研究通过诱导GBM细胞自噬发现泛素连接酶HERC3上调并泛素化降解SMAD7,从而激活TGF-β通路,最终诱导GBM细胞EMT发生,为洞察了解GBM的放化疗抵抗提供新的视角。第一章 自噬条件下胶质母细胞瘤细胞相关蛋白组学分析方法:用浓度为200nM Rapamycin分别处理U87MG细胞6h、8h、12h、24h、48h,而后进行同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)蛋白组学分析。结果:iTRAQ蛋白组学分析证实,伴随细胞进入自噬状态,泛素连接酶HERC3,以及TGF-β通路重要蛋白SMAD3、PAI1表达明显上调,而SMAD7下调。第二章 HERC3对GBM预后的影响方法:利用免疫组织化学染色及western blot检测胶质瘤组织芯片、肿瘤标本以及5对GBM原代细胞株HERC3的蛋白量。进一步通过癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)的数据以及南方医院神经外科所采集的1 10例GBM患者随访资料进行生存分析,研究HERC3与GBM患者预后的相关性。结果:HERC3表达与GBM的恶性程度正相关,且与GBM细胞的侵袭性正相关。第三章 HERC3在胶质母细胞瘤中的生物学作用方法:TMZ、LG、Rapa处理GBM细胞不同时间段后,Western blot及免疫荧光验证HERC3表达情况,并依据上述结果在HERC3表达高峰通过免疫细胞化学染色研究其表达量及形态变化。抑制细胞自噬水平后,Western blot验证HERC3及TGF-β通路激活相关蛋白表达。在两个不同HERC3表达背景的细胞(LN229高表达HERC3,T98G低表达HERC3)中,利用慢病毒分别干扰和过表达HERC3后,采用Western blot、划痕迁移实验、Transwell小室侵袭实验检测细胞生物学、表型改变及TGF-β通路激活情况。结果:TMZ、LG、Rapa处理GBM细胞后,随作用时间延长HERC3表达量逐渐上升,于12-16小时左右达高峰,与iTRAQ蛋白质组学分析结果一致,免疫细胞化学染色及免疫荧光染色显示,HERC3表达明显上调且入核增多,细胞纤细且触手增长。细胞自噬水平受抑后,HERC3表达及TGF-β通路受抑。LN229稳定干扰HERC3后,SMAD7表达上调,而TGF-β通路及细胞迁移和侵袭能力受抑。T98G稳定过表达HERC3后,SMAD7表达下调,而TGF-β通路激活,细胞迁移和侵袭能力增强。第四章 HERC3介导TGF-β通路激活方法:构建SBE荧光素酶报告基因质粒,合成TGF-β通路下游PAI1及NOTCH1引物,采用荧光素酶报告基因及QRT-PCR检测HERC3对TGF-β通路的作用,并通过Western blot检测HERC3在蛋白水平对TGF-β通路的影响。结果:荧光素酶报告基因、QRT-PCR、Western blot等实验均证实,HERC3可上调TGF-β通路下游靶基因PAI1及NOTCH1表达,并介导胶质瘤细胞发生EMT。第五章 HERC3诱导SMAD7泛素化并通过自噬溶酶体降解方法:构建Myc-HERC3,Flag-SMAD7,HA-Ub过表达质粒,利用放线菌酮(CHX)干扰蛋白合成,Western blot检测Flag-SMAD7表达水平,并免疫共沉淀检测HERC3对内、外源性SMAD7泛素化水平的影响。梯度过表达Myc-HERC3,Western blot检测Flag-SMAD7表达水平。自噬抑制剂3-MA,氯喹(CQ)及蛋白酶体抑制剂MG132处理Rapamycin诱导后的LN229细胞,Western blot检测SMAD7表达水平。结果:Flag-SMAD7表达量的下调表现出对HERC3及泛素的依赖性,IP证实内、外源性过表达HERC3后SMAD7泛素化水平增高。提示HERC3作为泛素连接酶介导了SMAD7的泛素化降解。自噬抑制剂3-MA和氯喹(CQ)能逆转Rapamycin所诱导的SMAD7下调,而MG132(蛋白酶体抑制剂)不能。提示:HERC3诱导SMAD7泛素化降解,并通过自噬溶酶体降解而非蛋白酶体。