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研究背景乳腺癌（Breast cancer）是一种很常见的女性恶性肿瘤,在女性癌症相关死亡中居于首位,在其不同亚型中,三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）因其具有侵袭性强、复发率高、预后差等特征已成为近年来研究和关注的焦点。TNBC由于缺乏有效的特异性生物标志而使其临床治疗面临重大挑战。因此,寻找和开发新的抗三阴性乳腺癌药物迫在眉睫。天然产物一直是药物开发的宝库,从天然药物中寻找新的抗乳腺癌药物,仍然是乳腺癌治疗中的一种重要策略。异鼠李素（Isorhamnetin,IH）是一种从胡颓子科植物沙棘Hippophae fhamnoides L的果实中分离提纯的黄酮类化合物。我们在研究中发现,异鼠李素能够选择性地抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖,并且通过氯喹（Chloroquine,CQ）阻断自噬降解能够显著增强异鼠李素对三阴性乳腺癌细胞增殖的抑制作用。因此,氯喹联合异鼠李素有望成为一种新型的抗三阴性乳腺癌药物组合。本课题对氯喹协同异鼠李素抑制三阴性乳腺癌细胞增殖的具体分子机制进行了深入研究。研究目的阐明氯喹协同异鼠李素抑制三阴性乳腺癌细胞增殖的具体分子机制,为将CQ+IH开发为新的药物组合用于三阴性乳腺癌治疗奠定基础。研究方法三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231和BT549）经氯喹和异鼠李素处理后,通过流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧变化情况;采用免疫荧光激光共聚焦观察线粒体分裂、线粒体自噬及相关蛋白共定位情况;采用Western blot检测相关蛋白变化情况;裸鼠移植瘤经药物处理后,采用免疫组织化学技术检测瘤体内相关蛋白表达变化情况。研究内容和结果1.异鼠李素诱导三阴性乳腺癌细胞产生自噬三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231和BT549）经异鼠李素（IH）处理后,Western blot检测发现IH可使乳腺癌细胞中自噬标志性蛋白LC3B-II及自噬形成关键蛋白Beclin1和ATG5的表达增加,自噬受体蛋白p62的表达降低。进一步通过双荧光转染发现IH处理组同自噬诱导剂Rapamycin组相似,出现大量的红色荧光团,说明IH诱导三阴性乳腺癌细胞产生自噬。2.氯喹显著增强异鼠李素对三阴性乳腺癌细胞增殖的抑制作用并诱导细胞发生凋亡与单用氯喹（Chloroquine,CQ）或异鼠李素（Isorhamnetin,IH）相比,低浓度的CQ（20?M）同IH（10?M）联用后,能够明显增加IH对三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231和BT549）的抑制作用,而对雌激素受体依赖乳腺癌MCF-7细胞影响较小,对正常乳腺MCF-10A细胞几乎无作用。随后对其联用系数进行了计算,发现在两株三阴性乳腺癌MDA-MB-231和BT549种其联用指数均小于1,而在MCF-7种其联用指数大于1,说明氯喹具有协同异鼠李素抑制三阴性乳腺癌细胞增殖的能力。流式细胞术检测结果表明,CQ+IH可诱导三阴性乳腺癌细胞发生凋亡,Western blot结果显示凋亡标志性蛋白Cleaved-Caspase3表达增加,Cyto C释放到胞浆以及促凋亡蛋白Bax转位到线粒体。3.氯喹协同异鼠李素导致自噬体过度堆积诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡Western blot检测发现,CQ+IH可明显增加LC3B-II在线粒体上的聚集。采用shRNA敲降自噬形成关键蛋白ATG5后,能显著降低CQ+IH导致的自噬体堆积,同时也阻断了CQ+IH诱导的细胞凋亡。4.氯喹协同异鼠李素通过促进CaMKⅡ（T286）和Drp1（S616）磷酸化及线粒体转位诱导乳腺癌细胞发生线粒体分裂和细胞凋亡Western blot检测发现CQ+IH可导致Drp1（S616）和CaMKⅡ（T286）磷酸化水平明显增加,而对Drp1（S637）磷酸化水平则无影响,Western blot和激光共聚焦观察发现CQ+IH可导致Drp1及CaMKⅡ转位到线粒体,免疫沉淀和激光共聚焦发现CQ+IH可增加CaMKⅡ和Drp1的结合和共定位。通过构建CaMKIIT286A质粒模拟CaMKⅡ去磷酸化失活状态,CaMKIIT286D模拟CaMKⅡ磷酸化激活状态,发现转染CaMKIIT286A质粒可减弱CQ+IH导致的CaMKⅡ（T286）和Drp1（S616）磷酸化及两者的线粒体转位,减弱CQ+IH诱导的线粒体分裂和细胞凋亡,而转染CaMKIIT286D质粒则进一步增强CQ+IH导致的CaMKⅡ（T286）和Drp1（S616）磷酸化及两者的线粒体转位,增强CQ+IH诱导的线粒体分裂和细胞凋亡。进一步采用shRNA敲降CaMKⅡ可减弱CQ+IH诱导的Drp1 S616磷酸化及其线粒体转位,同时阻断CQ+IH导致的线粒体分裂和细胞凋亡。5.氯喹协同异鼠李素诱导三阴性乳腺癌细胞产生ROS流式细胞术检测发现,CQ+IH可导致乳腺癌细胞产生ROS,进一步研究发现,CQ+IH诱导产生的ROS为超氧阴离子（O2·-）,通过超氧阴离子清除剂TBAP预处理细胞可阻断CQ+IH诱导的线粒体分裂和细胞凋亡,同时阻断CaMKⅡ（T286）和Drp1（S616）的磷酸化及两者的线粒体转位。6.氯喹协同异鼠李素抑制裸鼠移植瘤生长通过构建MDA-MB-231的裸鼠移植瘤模型,腹腔注射氯喹和异鼠李素进行干预发现,CQ+IH能够明显延长裸鼠生存时间,抑制肿瘤生长速度。采用免疫组织化学技术发现CQ+IH可促进移植瘤发生细胞凋亡,同时伴随着CaMKⅡ（T286）和Drp1（S616）的磷酸化。结论通过氯喹抑制自噬降解能够特异性地增强IH诱导的三阴性乳腺癌细胞发生线粒体分裂和细胞凋亡,进一步研究发现,CQ+IH可导致乳腺癌细胞内大量的ROS（尤其是超氧阴离子）积累,使CaMKⅡ（T286）发生磷酸化激活,进而使Drp1（S616）发生磷酸化激活,激活后的CaMKⅡ和Drp1转位到线粒体,使线粒体发生分裂最终导致细胞凋亡。研究结果说明IH有望成为一种新的化疗药物,将其与CQ联用有望成为一种新的治疗策略用于三阴性乳腺癌治疗,具有一定的应用价值。