论文部分内容阅读
嗜人按蚊不仅骚扰和叮刺人畜,而且能传播疟疾、马来丝虫病,对人类的健康危害很大。而通过选择性地抑制雌蚊的吸血或产卵,则有可能达到控制嗜人按蚊繁殖和阻断其传播相关疾病的目的。
本研究以嗜人按蚊为研究对象,应用抑制消减杂交(Suppression subtractivehybridization,SSH)技术建立了嗜人按蚊性别差异表达cDNA文库,并结合基因芯片技术对嗜人按蚊雌蚊差异表达基因进行了初步筛选,利用半定量RT-PCR和Real TimePCR对基因芯片表达谱筛选得到差异表达基因进行了验证。
本实验应用SSH技术,以嗜人按雌蚊成蚊的cDNA为Tester、雄蚊成蚊的cDNA为Driver,进行正向抑制性消减杂交;以雄蚊成蚊的cDNA为Tester、雌蚊成蚊的cDNA为Driver,进行反向抑制性消减杂交。将正向SSH的第二轮抑制性PCR产物直接连接到pGEM-T easy载体中,转化到感受态细胞中培养,然后将3074个菌液PCR产物送芯片公司进行表达谱芯片实验,采用双色荧光交换实验和片内重复一次及片问重复四次实验,降低了芯片实验自身的误差,用SAM统计学软件分析基因的差异表达情况。结果表明:当delta值为3.319,所选择的差异性表达的假阳性率为0%时,相对于雄蚊,在雌蚊中上调的基因共计241个;在雌蚊中下调的基因,共计2个。当delta值为0.331,所选择的差异性表达的假阳性率为9.73%时,相对于雄蚊,在雌蚊中上调的基因共计1274个;在雌蚊中下调的基因,共计609个。
最后,本研究应用RT-PCR和Real Time PCR技术,对得到的差异表达的部分基因进行验证。结果表明,基因芯片的结果与RT-PCR和Real Time PCR的总体一致,但是表达差异值有一些差异。
选择差异倍数值大、可信度高,相对于雄蚊,在雌蚊中上调的400个克隆进行测序,得到有效ESTs共139个。将EST上传到美国生物信息中心网站,进行在线BLAST分析发现,得到的这些EST中有与冈比亚按蚊同源的序列以及一些未知序列,这些同源序列中有部分已经被证实在雌蚊中差异表达如唾液腺相关蛋白。筛选得到的这些差异表达基因为研制嗜人按蚊性别控制疫苗或药物奠定了基础。