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背景与目的:
白血病是一类异质性造血干细胞恶性克隆性疾病。目前造血干细胞移植被认为是治愈急性白血病唯一有效的方法,但是存在HLA相合配型难及费用昂贵等问题,药物的化疗仍是急性白血病治疗的主要手段。近年来随着联合化疗方案的不断改进,白血病的完全缓解率得到了很大提高,但仍有部分患者存在初发难治、复发等问题,其主要原因是白血病细胞存在原发及继发耐药。因此寻找提高白血病对化疗药物敏感性的方法,加强白血病辅助治疗的效果,对于改善白血病的预后具有十分重要的意义。
凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)是一类在结构上具有同源性的细胞内源性凋亡抑制蛋白家族。X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(X—linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)被认为是IAPs中抗凋亡作用最强的成员之一。研究发现XIAP参与了肿瘤的发生、发展,并与肿瘤的化疗耐药密切相关。目前为止,关于XIAP的表达与肿瘤的预后及化疗耐药的研究仍有争议,尚不明确下调XIAP的表达是否能改善白血病细胞对化疗药物的敏感性以及相关机制。
本实验通过观察三种白血病细胞株及正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC) XIAP的表达水平,探讨XIAP在白血病细胞中的表达情况。设计合成具有良好沉默效应的XIAP小分子干扰RNA(smallinterfering RNA,siRNA),研究应用siRNA抑制白血病细胞XIAP表达的可行性,观察下调XIAP后细胞对化疗药物敏感性的变化,初步探讨其机制。
方法:
1、培养人慢性髓性白血病细胞K562、人急性早幼粒白血病细胞HL—60、人急性淋巴母细胞白血病细胞MOLT—4,分离正常人PBMC,采用实时荧光定量PCR和Western blot检测四种细胞中XIAP mRNA和XIAP蛋白的表达情况。
2、针对XIAP mRNA体外化学合成siRNA,采用Nucleo fectorTM核酸转染仪对XIAP高表达的细胞转染XIAP siRNA,流式细胞仪检测转染效率。用实时荧光定量PCR和Western blot检测转染后细胞中XIAP mRNA和XIAP蛋白的表达情况。检测转染后细胞在不同浓度化疗药物作用下的抑制情况,计算半数抑制浓度(inhibitory concentration50,IC50),比较转染前后细胞对化疗药物敏感性的变化,观察其变化是否通过XIAP表达下调起作用。用流式细胞仪及Hochest染色法检测细胞凋亡,了解细胞凋亡与细胞对化疗药物敏感性的关系。
结果:
1、MOLT—4、HL—60、K562细胞中XIAP mRNA及蛋白表达量均明显高于正常人PBMC(P<0.05),其中K562细胞XIAP的表达量最高(P<0.05)。
2、应用XIAP siRNA及阴性对照siRNA转染K562细胞,阴性对照组、空白细胞组、单纯电击组间XIAP表达无明显差异(P>0.05);实验组与阴性对照组比较,转染后24h、48h、72h XIAP mRNA及蛋白水平均有明显下调(P<0.05),48h下调效果最明显。
3、在不加化疗药物的条件下,实验组、阴性对照组、空白细胞组、单纯电击组四组间比较,细胞凋亡率和caspase—3活性无明显差异(P>0.05)。加入化疗药后,阴性对照组、空白细胞组、单纯电击组三组间比较,细胞凋亡率和caspase—3活性无明显差异(P>0.05);实验组与阴性对照组比较,细胞凋亡率和caspase—3活性明显升高(P<0.05)。加入化疗药后,Hoechst33258染色发现,与阴性对照组比较,实验组含有的核皱缩,浓染和碎裂等凋亡形态的细胞明显增多。
4、应用XIAP siRNA转染K562细胞,实验组与阴性对照组比较,阿糖胞苷和依托泊苷对细胞的IC50明显下降(P<0.05)。
结论:
1、XIAP在白血病细胞-MOLT-4、HL-60、K562内高表达,其中K562细胞XIAP的表达水平最高。
2、XIAP siRNA能特异性下调K562细胞的XIAP mRNA和蛋白质水平的表达。
3、体外合成的siRNA转染细胞,其作用是瞬时性的,持续时间24~72h左右。
4、RNAi下调XIAP的表达,增强了K562细胞对阿糖胞苷和依托泊苷的敏感性,同时伴随细胞凋亡及caspase-3活性的增加。