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背景随着宫颈癌筛查的普及,高级别宫颈上皮内瘤变CIN的发病人数逐渐增加。宫颈锥切术可治疗高级别CIN并有效减少宫颈癌的发生,但宫颈锥切术后部分患者仍会出现病变残留或复发,发展为宫颈癌的几率仍高于普通人群。锥切术后的随访与处理是初筛之后防治宫颈癌的关键问题。锥切术后高危型HPV持续感染是病变复发的高危因素,但目前对HPV感染尚无有效的治疗手段。2012年ASCCP指南中,对于持续或复发性高级别CIN患者的治疗,可以再次锥切或子宫切除术。对于有生育要求的女性,不适合进行子宫切除术,而再次锥切可能导致宫颈机能不全、流产、早产等并发症。因此,需要一种既可以保留宫颈又能治疗宫颈病变的手段。光动力疗法PDT是一种新的微创治疗手段,在宫颈病变的治疗中仍处于探索阶段。第—部分：宫颈上皮内瘤变锥切术后病变残留或复发的临床诊治分析目的分析宫颈细胞学检查TCT、HPV检测、阴道镜检查以及宫颈活检在宫颈锥切术后病变残留或复发的临床应用价值。方法选择2012年1月至2015年7月于山东大学齐鲁医院就诊、有CIN宫颈锥切手术史并接受阴道镜检查的患者,分析其临床病理资料,以组织病理学结果为诊断“金标准”,以宫颈活检或宫颈管搔刮术ECC或手术的最高病理诊断为最终诊断。计算TCT、HPV、阴道镜检查的敏感性及特异性,对阴道镜诊断与病理诊断进行一致性检验,采用自身对照分析阴道镜下活检与再次手术的病理变化。结果1、317名宫颈锥切术后患者纳入该研究,共接受355次阴道镜引导下宫颈活检,患者平均年龄(41.1±7.8)岁。以活检或再次手术最高病理诊断为最终诊断,共145例宫颈正常或炎症,90例低级别鳞状上皮内瘤变LSIL,118例HSIL,2例微小浸润癌。2、TCT、HPV、阴道镜诊断HSIL+(HSIL及浸润癌)的敏感性(95%CI)分别为：69.1%(58.4%-79.8%),96.7%(92.5%-100.0%),61.7%(55.8%-67.5%)；特异性(95%CI)分别为：65.6%(59.9%-71.3%),13.9%(9.8%-18.00%),95.7%(93.3%-98.2%)。TCT、HPV、阴道镜诊断SIL+(LSIL及以上病变)的敏感性(95%CI)分别为：57.6%(50.7%-64.50%),93.8%(90.5%-97.2%),76.7%(71.6%-81.7%)；特异性(95%CI)分别为70.7%(65.3%-76.1%),16.4%(12.0%-20.8%),63.4%(57.7%-69.2%)。3、阴道镜诊断印象与最终病理诊断完全一致率为59.7%(212/355),一致性检Kappa值为0.40(P<0.05)：宫颈不同转化区类型的完全一致率分别为：1型57.6%(76/132),2型61.9%(60/97),3型60.3%(76/126),差异无统计学意义。一个级别之内(指两者诊断病变的级别一致或仅相差1个级别)的符合率为95.2%(338/355)。阴道镜过高诊断率为16.1%(57/355),诊断不足率为24.2%(86/355)。当阴道镜诊断印象为正常或炎症时,完全一致率为63.2%(84/133),诊断不足率为36.8%(49/133)；诊断印象为LSIL时,完全一致率为36.2%(47/130),诊断不足率为27.7%(36/130)；诊断印象为HSIL时,一致率为86.9%(73/84),诊断不足率为1.2%(1/84)；差异具有统计学意义。因此,阴道镜诊断为正常或LSIL时的一致率显著低于诊断为HSIL时的一致率。4、ECC情况：355次阴道镜检查中共156例接受ECC检查,10.3%(16/156)未刮出颈管组织,8.3%(13/156)因颈管狭窄ECC探查失败；共129例宫颈管组织送检,85.8%(109/129)病理未查见病变NILM,1.6%(2/129)为LSIL,12.6%(16/129)为HSIL。2.5%(3/120)的HSIL患者通过ECC检出,而宫颈活检为阴性。5、123名宫颈锥切术后患者接受再次手术,阴道镜下宫颈活检及ECC与手术病理比较发现,两者一致率为55.3%(68/123),术后病理降级者占42.3%(52/123),术后病理升级比例占2.4%(3/123),手术发现2例微小浸润癌,术前活检分别为LSIL和HSIL。6、治疗方面：活检为HSIL患者,112例再次锥切或全子宫切除术,4例纳入氨基酮戊酸光动力疗法ALA-PDTI临床试验接受治疗,其中3例有效,1例因病变持续再次接受宫颈锥切术；11例活检为LSIL患者均接受再次宫颈锥切术；2例术后高危型HPV持续超过1年患者纳入ALA-PDT临床试验,仍在随访中。结论1、HPV检测对宫颈锥切术后残留或复发病变的诊断敏感性高,特异性低,TCT的特异性高,敏感性低,仅对细胞学阳性者转诊阴道镜检查,会漏诊部分高级别复发性宫颈病变。2、阴道镜诊断印象为正常或LSIL时,有诊断不足的风险；仅对阴道镜检查阳性者行子宫颈活检,会漏诊部分持续或复发性高级别宫颈病变。3、宫颈管搔刮术有助于提高锥切术后病变残留或复发病变的检出率。4、PDT在宫颈锥切术后持续或复发性病变的应用有待于继续研究。第二部分：光动力疗法对人宫颈永生化上皮细胞H8细胞生物学特性的影响及其作用机制的初步探索目的观察新型水溶性光敏剂-四甲基吡啶卟啉TMPyP为光敏剂的光动力疗法(TMPyP-PDT)对H8细胞(HPV16型E6/E7基因永生化的人宫颈上皮细胞)生物学行为的影响,并初步探索其作用机制。方法倒置显微镜下观察TMPyP-PDT处理H8细胞后的形态；荧光显微镜紫外激发下观察光敏剂在细胞中的定位；使用细胞计数试剂盒CCK-8法检测细胞的增值活力；AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡；免疫细胞化学SABC法检测TMPyP-PDT对H8细胞p16INK4a/Ki67蛋白表达的变化；蛋白免疫印迹技术(Western Blotting)检测ERK、JNK、人端粒酶逆转录酶hTER、p21蛋白及p16INK4a的表达。结果光敏剂TMPyP主要分布于细胞核内,TMPyP-PDT可以改变H8细胞的形态,抑制细胞增殖,降低细胞存活率,其作用与光敏剂TMPyP的浓度有关；TMPyP-PDT诱导H8细胞发生凋亡；免疫细胞化学显示,TMPyP-PDT可降低H8细胞p16INK4a和Ki67蛋白的表达；Western Blotting显示,TMPyP-PDT可以降低H8细胞ERK和JNK的磷酸化水平,降低hTERT、p16INK4a的表达,而使H8细胞p21蛋白表达升高。结论TMPyP-PDT可以抑制H8细胞的增殖,诱导细胞凋亡,降低p16INK4a/Ki67蛋白的表达。其作用机制可能与ERK和JNK的磷酸化水平下降、hTERT及p16INK4a的降低以及上调p21的表达有关。