论文部分内容阅读
本研究分为二部分:
一、天花粉蛋白诱导树突状细胞产生IL-10 调节免疫应答
天花粉蛋白（trichosanthin, Tk）由我国学者最早分离，之后围绕其特性和生物学功能进行了大量的多学科研究。在临床应用方面发现，天花粉蛋白除了破坏滋养层细胞，用于引产以外，还能诱导肿瘤细胞凋亡，抑制HIV、乙型肝炎等病毒的复制和增殖。近年来发现Tk 具有免疫抑制功能，一系列研究证实，Tk 通过抗原提呈细胞（antigen presenting cells,APC）和CD8 阳性的T 细胞亚群发挥免疫抑制作用，并且其诱导的免疫抑制与MHC 背景密切相关。我们采用Tk 敏感小鼠品系C57BL/6 骨髓来源的树突状细胞（bone marrow derived dendritic cells, BMDC），深入分析了Tk 对树突状细胞（dendritic cells, DCs）表型、细胞因子分泌格局、刺激T 细胞增殖能力以及诱导Th1/Th2 分化的影响。
研究结果发现，0.05～1 μg/ml Tk 以剂量依赖的形式显著抑制同种异体抗原诱导的T 细胞增殖。低浓度的Tk 就能显著抑制混合淋巴细胞反应中IL-2 和IFN-γ的含量，同时IL-10 和IL-4 的表达增加；抗体封闭实验表明IL-10 和IL-4与Tk 的免疫抑制作用直接相关。进一步，用Tk 处理体外诱导培养第6天的DCs，发现Tk 可以促进DCs 表达IL-10。此外，经Tk 预处理过的DCs 在LPS 刺激下，分泌IL-10 增加，而IL-12 表达明显减少，这些结果提示Tk 可以上调DCs 分泌的IL-10/IL-12 比例，从而抑制Th1 型为主的免疫应答。
通过IL-10-/-小鼠来源的DCs，我们证明DCs 分泌的IL-10在Tk 活性中发挥重要作用，是启动APC 依赖的免疫抑制作用的关键因素。我们还发现，Tk 促进DCs 的IL-10 基因表达与激活细胞MAPK（mitogen activated protein kinase）JNK 信号通路有关。为了进一步探讨Tk 可能的应用，我们研究了Tk 在体内对抗原特异性免疫应答的调节作用，发现在OVA 抗原免疫的同时加入Tk，或用Tk 与OVA 同时脉冲处理的DCs 免疫动物，均可以显著抑制T 细胞对OVA 抗原的再次应答，并且证实这种免疫抑制作用与T 细胞分泌的IL-10 和IL-4 有关，表明Tk在体内可以调节对抗原免疫应答的Th1/Th2 类型。
最后，我们研究了Tk对实验性自身免疫性脑脊髓炎（ experimental autoimmuneencephalomyelitis, EAE）的治疗作用，结果发现， Tk（0.5 μg/ml）与MOG 肽（自身抗原髓鞘碱性蛋白衍生肽）共同脉冲处理的DCs 可以起到明显抑制EAE 发病的作用。体外实验表明Tk 治疗组EAE 小鼠T 细胞对抗原（MOG）刺激的增殖显著降低，而且Tk 改变了MOG 特异性T细胞的反应格局，增加了IL-10，减少了IL-2 和IFN-γ的表达。总之，我们的结果提示，① Tk 通过诱导DCs 分泌IL-10 抑制免疫应答，② Tk可以在体内诱导抗原特异性的免疫调节作用，③TK 修饰的DCs 疫苗对EAE 的发病能起到预防作用。以上这些结果为进一步开发Tk 的临床应用提供了理论基础和实验依据。
二、MHC II 类反式激活因子对IL-4 基因的表观遗传学调控
MHC II 类反式激活因子(class II transactivator, CIITA)是MHC II 类分子表达的“分子开关”，近来发现CIITA 也参与调控其它基因表达。本实验发现，在Jurkat 细胞株中，转染CIITA 能抑制PMA 和Ionomycin 激活的IL-4 基因转录，而去乙酰化酶抑制剂TSA 可以逆转CIITA 对IL-4 表达的抑制作用。染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）
结果表明，与转染空质粒的对照细胞相比，过表达CIITA 的Jurkat 细胞在PMA 和Ionomycin 刺激后，IL-4 基因启动子区组蛋白H3 和H4 乙酰化水平明显降低。另一方面，用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA 处理细胞24 小时能抑制CIITA 诱导的IL-4 启动子区组蛋白H3 和H4 去乙酰化，有利与IL-4 基因表达。组蛋白的乙酰化状态会影响基因的结构，发挥对基因的表观遗传学调节作用。我们发现，在转染CIITA 的Jurkat 细胞中，IL-4 基因活化所需要的转录因子CBP/p300，STAT6 和NFAT 的表达水平虽然没有受到影响，但他们与IL-4 启动子上的结合却受到明显抑制。
TSA 处理能使转录因子重新结合到IL-4 基因上，充分说明CIITA 通过组蛋白去乙酰化，影响了IL-4 基因局部结构，降低其对转录因子的可接近性，使IL-4 基因表达受到抑制。进一步我们发现，CIITA 小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）一方面能抑制体外分化的Th1 和Th2 细胞内源性CIITA 和MHC II 类分子的表达，同时也能促使Th1 细胞分泌IL-4，而不影响其IFN-γ的表达。以上研究结果充分表明，CIITA 通过表观遗传学机制参与IL-4 基因的表达，并影响Th1/Th2 分化过程。本实验为深入了解CIITA 在免疫系统中的功能提供了新的线索。