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牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国重要的经济海水养殖鱼类之一,其肉质鲜美,蛋白质含量高,具有较高的营养价值,此外,牙鲆的生长速率具有明显的性别差异,单性养殖可以有效地提高经济效益。精巢发育是行有性生殖动物繁殖的基础,而精子发生则是精巢正常发育的关键。精子发生主要指二倍体精原细胞通过减数分裂等一系列复杂的生化反应,进而产生成熟的单倍体精子的过程。尽管我们对精子发生的理解有了长足的进步,相关基因和化学物质的研究也不断被发现和鉴定,但目前,关于牙鲆性腺发育和精子发生的研究多集中于性激素和性别分化相关基因的表达分析方面。此外,性腺发育和精子发生相关基因的研究又多集中于这些编码基因的表达规律和功能分析,对其转录后水平调控研究鲜有报道,而该领域正是目前遗传学研究的热点。本实验室前期通过高通量测序等技术建立了牙鲆精巢和卵巢miRNA文库,并筛选出一批在雌雄性腺中差异表达的miRNA,其中,miR-202-5p是性腺中丰富表达,且雌雄表达差异显著的一个miRNA。在此基础上,本研究采用荧光定量PCR和原位杂交技术构建miR-202-5p在牙鲆不同组织和性腺发育过程中的表达谱。结果显示,miR-202-5p在牙鲆精巢中特异性高表达,卵巢次之,在其他组织中几乎不表达。利用化学原位杂交(in situ hybridization,ISH)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术检测miR-202-5p在精卵巢组织中的表达定位,ISH结果表明,miR-202-5p仅在IV期的卵母细胞中有较强烈杂交信号,而在其他时期的卵母细胞中杂交信号微弱,与miR-202-5p的表达模式不同,在I、II、III等早期的卵母细胞中均检测到强烈的vasa杂交信号。而在IV、V时期的卵母细胞中vasa的杂交信号逐渐减弱;在精巢中,miR-202-5p表现出与vasa相似的表达模式,其均在精原细胞和精母细胞中检测到强烈的杂交信号,而在精子细胞和成熟精子中杂交信号微弱。与ISH结果相一致,FISH结果发现,在精巢中,miR-202-5p的荧光信号主要集中于精原细胞和精母细胞中,这与vasa表达模式相似;而在卵巢中,vasa的荧光信号随着卵母细胞发育逐渐减弱,miR-202-5p表现出与vasa不同的表达模式,仅在IV期卵母细胞中检测到较强的荧光信号。这种精巢特异性的表达模式表明miR-202-5p可能与精巢发育和精子发生有关。为进一步发掘miR-202-5p在精巢发育和精子发生中的功能,我们利用活体注射视磺酸的方法研究了视磺酸(RA)与miR-202-5p以及精子发生精巢发育相关的基因cbx2、ccnd1、sox9、smad1/3、bmp3/5、tgf-β3等之间的关系。视磺酸活体注射结果表明,视磺酸注射后,miR-202-5p表达量升高,表明视磺酸对miR-202-5p的表达具有促进作用;精巢发育精子发生相关基因中,cbx2和ccnd1表达量下降,而sox9、smad1/3、bmp3/5、tgf-β3的表达量则上升。Mi RNAs靶基因的预测与鉴定,是研究miRNAs功能的关键依据。本研究采用生物信息学方法预测视磺酸注射实验中与miR-202-5p表达量变化相反的cbx2和ccnd1等基因与miR-202-5p种子序列之间的互补关系。预测结果表明,ccnd1 3′UTR区与miR-202-5p的种子序列完全互补;cbx2 3′UTR区仅与miR-202-5p的种子序列第六位不互补,其余位点均互补,符合当miRNA与靶基因不完全互补时,miRNA仍可以通过与靶基因3′UTR区结合,阻遏其转录后翻译的调控方式。为了进一步探讨miR-202-5p与cbx2和ccnd1之间的作用关系,本研究采用双荧光素酶报告基因技术鉴定了miR-202-5p与cbx2和ccnd1之间的靶向关系。初步鉴定结果显示,cbx2和ccnd1均为miR-202-5p直接作用的靶基因,表明miR-202-5p可能通过调节cbx2和ccnd1等基因在精巢发育和精子发生中发挥重要作用。最后,本研究通过在体外培养的精巢组织中过表达或抑制miR-202-5p的方法进一步验证miR-202-5p与cbx2和ccnd1间的作用关系。结果显示,转染miR-202-5p mimics的实验组,miR-202-5p表达量上升,cbx2、ccnd1表达量下降;转染miR-202-5p antagomir的实验组,miR-202-5p表达量下降,而cbx2、ccnd1表达量上升。为了尽量排除精巢体细胞的干扰,本研究还通过转染体外培养的原代生殖细胞的方法检测了miR-202-5p、cbx2和ccnd1的表达变化。结果与转染体外培养的精巢组织相似,转染miR-202-5p mimics后,随着miR-202-5p表达升高,cbx2、ccnd1表达量降低;而转染miR-202-5p antagomir后,伴随miR-202-5p表达量降低,cbx2、ccnd1表达量升高。进一步表明在牙鲆精巢组织和细胞中cbx2和ccnd1是受miR-202-5p调节的靶基因。综上所述,本研究为进一步探讨miR-202-5p在牙鲆精子发生和精巢发育中的作用机制提供了新的资料。