本论文研究内容涉及分析化学、化学生物学等二级学科,属交叉学科研究领域。主要在生物质谱技术的基础上,发展针对蛋白质N型糖基化修饰定性与定量研究的创新性技术与方法,以准确、高效地揭示蛋白质N-糖基化修饰的多方面信息,包括糖蛋白／糖肽、糖基化位点、糖链等。糖基化修饰是生命活动中最广泛、最复杂、也是最重要的蛋白质翻译后修饰之一,不仅影响着蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位,而且在分子识别、细胞通信、信号转导等特定生物过程中发挥着至关重要的作用。糖蛋白根据其糖链结构及糖基化位点的不同可分为三大类：N-糖蛋白、O-糖蛋白和GPI锚定蛋白,其中又以N-糖蛋白分布最为广泛。据推断,有超过50%的蛋白质都发生了糖基化修饰,但是现有数据库中只有约10%的蛋白质被注释为糖蛋白,说明绝大多数糖蛋白尚未被发现。糖基化研究仍处于起步阶段,缺乏高效的、成熟的技术手段。在后基因组时代,基于对蛋白质高通量、系统性研究的蛋白质组学迅速兴起。而以软电离为基础的生物质谱技术为蛋白质组学的快速发展提供了有力工具。近年来,生物质谱技术同样被应用于糖基化修饰的研究,主要包括糖基化位点的鉴定和糖链结构的解析等方面,而针对糖蛋白/糖链进行大规模研究的糖蛋白质组学和糖组学也随之应运而生。然而,糖链属非模板合成,其结构极其复杂且呈二维结构,同时糖链离子化效率低、同分异构体多,在质谱分析上仍存在诸多技术瓶颈。可见,糖基化领域的进一步发展亟待方法学上的新突破。本论文以生物质谱技术为基础,从定性研究和定量研究两方面,发展了针对蛋白质N-糖基化修饰研究的新技术与新方法,致力于建立高效、实用的糖基化解析策略,解决当今糖蛋白质组学与糖组学所面临的技术难题。本论文工作的主要贡献如下：(1)成功将糖苷内切酶(Endo)应用于大规模、高通量的N-糖基化位点质谱鉴定,与传统的肽N-糖酰胺酶(PNGase)形成互补,并利用这两种酶切路线,从大鼠肝脏组织中鉴定到大量尚未被发现或证实的N-糖基化位点；(2)首次发现Endo酶促N-糖18O标记反应,并基于此反应发展了酶促糖链还原末端18O标记GREOL技术,有效用于糖链的质谱相对定量,弥补了定量糖组学领域的一项技术空白；(3)通过条件优化,首次实现了PNGase酶促N-糖链的完全18O标记,并基于此反应创新性地发展了酶促18O4标记技术,成功用于糖链、糖肽、非糖肽的一步定量分析,在一次实验中实现了蛋白质N-糖基化的全方位定量解析；(4)发展了硼氢化钠辅助的酶促N-糖链墙18O技术与18O+D双标记技术,不仅大大增加了酶促糖链18O标记的稳定性,更通过双标记使糖链质量差异增加到3Da,大大降低了同位素峰重叠效应的影响。针对上述几点,本论文分别从以下几方面进行了阐述：基于糖苷内切酶(Endo)与肽N-糖酰胺酶(PNGase)互补的大规模N-糖基化位点鉴定：蛋白质糖基化位点的大规模鉴定是糖蛋白质组学定性研究的重要内容。PNGase F是目前普遍使用的鉴定N-糖基化位点的酶,该酶会使N-糖基化位点的天冬酰胺去氨基化并发生+0.98Da的质量变化,以此作为标签,即可质谱鉴定糖基化位点。然而,高通量、高效率的质谱分析难以兼顾灵敏度与分辨率,这使得0.98Da质量差异的精确分辨在大规模的LC-MS分析中难以得到保证。同时,天冬酰胺与天冬氨酸之间自然相互转换也时有发生,影响了糖基化位点鉴定的可信度。与PNGase F不同,Endo酶切糖链后在糖基化位点上保留最后一个GlcNAc,形成203Da质量差异,以此为标签,鉴定的准确性大大提高。然而,目前Endo尚被应用于大规模的糖基化位点鉴定。本论文将Endo H与传统PNGase F结合对大鼠肝脏组织的高甘露糖型和杂合型N-糖基化进行大规模位点鉴定,成功将Endo H应用于高通量、大规模的N-糖基化位点鉴定。利用凝集素Con A亲和富集、两种切糖酶酶切、LC-MS/MS检测分析的路线,共从大鼠肝脏组织中鉴定到1063个非冗余的高甘露糖型与杂合型N-糖基化位点及相应560个非冗余的N-糖蛋白,其中大部分N-糖基化位点为首次发现,为大鼠蛋白数据库提供了大量新的糖基化修饰信息。该部分的研究意义与创新性如下：(1)首次将Endo用于大规模的N-糖基化位点鉴定,证明了Endo应用于高通量糖蛋白质组学研究的可行性；(2)将PNGase F与Endo H两种酶切技术路线获得的结果相结合,得到了更大的N-糖基化位点数据集,其中包括大量尚未在大鼠中发现的N-糖基化位点与N-糖蛋白,显示了两种酶的非交盖性与互补性；(3)Endo酶切方法不仅提供了糖基化位点的糖链亚型结构,还提供了糖基化位点的核心岩藻糖信息,对糖基化位点特异性与不均一性研究、核心岩藻糖化糖蛋白研究都具有重要意义；(4)对Endo与PNGase两类酶在位点鉴定中的不同优势与特点进行了深入分析与讨论,简而言之,PNGase可以获得更多的鉴定结果,而Endo获得的结果可信度更高；(5)分析了Endo酶切方法存在的问题与不足,为进一步的深入优化与改进提供了方向。糖苷内切酶(Endo)催化N-糖链18O标记及其在定量糖组学中的应用：随着糖蛋白质组学的发展,针对蛋白质糖基化修饰的相对定量研究受到越来越多的关注,对探索生理病理过程中糖基化修饰的变化、寻找潜在的疾病标志物具有重要意义。高通量的糖链定量即定量糖组学,致力于研究不同生理病理条件下的复杂样本中糖链在结构类型、组成以及连接、构象精细结构上的相对量的变化。与定量蛋白质组学类似,基于质谱的稳定同位素标记也是定量糖组学研究的有效手段和发展方向,目前建立的标记技术包括还原末端标记、全甲基化标记和代谢标记。酶促18O标记是定量蛋白质组学中一项重要的标记定量技术。酶促’8O标记的最大优势在于其成本低廉、操作简单、标记效率高,因为标记反应在酶解过程中进行,除H218O外,不涉及任何额外的反应试剂,没有额外的反应步骤,也不会产生副反应。然而,酶促18O标记在定量糖组学领域仍是一项空白。而在使用Endo进行进一步的研究工作时我们发现,当在H218O中进行Endo酶切时,释放的N-糖链还原末端会被稳定地标记上一个18O原子。基于此反应,本论文发展了酶促糖链还原末端18O标记GREOL (glycan reducing-end18O labeling)技术,并创新性地建立了酶促糖链同位素标记定量策略。Endo酶促反应使所有酶切释放的N-糖链都可以稳定、完全地标记上一个18O原子,且适用于所有Endo亚型。而基于该反应的GREOL技术经质谱分析与去卷积修正后,在至少两个数量级范围内显示出良好的线性与重复性,及较高的检测灵敏度,可有效应用于定量糖组学。利用该技术的特点,我们还实现了一些分子量相同而结构类型不同的N-糖链同分异构体之间的定量分辨。为了进一步证明GREOL相对定量在复杂生物样品中的可靠性,我们还将该技术应用于肝细胞肝癌相关定量血清糖组学研究。该部分的研究意义与创新性如下：(1)首次发现在H218O反应体系中,Endo在酶切释放N-糖链的同时,稳定地在N-糖链还原末端引入一个18O原子,标记效率为100%；(2)基于该反应,建立了酶促同位素18O标记定量的GREOL技术,首次将酶促同位素标记应用于糖链的质谱相对定量,弥补了定量糖组学领域的一项空白；(3)深入探讨了Endo酶促18O标记的反应机理,并建立了针对该标记的质谱数据去卷积修正方法,最大程度地避免同位素峰重叠造成的影响,使GREOL定量展示出良好的线性、重复性和灵敏度；(4)利用GREOL技术,首次实现了一些N-糖链同分异构体的定量分辨,使相对定量不再局限于相同结构的糖链之间,为定量糖组学研究提供了崭新的视角；(5)利用GREOL技术,发现肝细胞肝癌相关的血清N-糖链中,双链复杂型糖链、平分型GlcNAc结构水平、唾液酸水平均呈上调趋势,提示肝癌的发生发展同这些结构的定量改变关系密切,为进一步的功能研究、寻找潜在的诊断标志物奠定了基础。肽N-糖酰胺酶(PNGase)催化的一步18O4标记及其在蛋白质N-糖基化定量研究中的应用：与Endo相比,传统PNGase酶切的是糖链末端与糖基化位点间的酰胺键,其反应机制与糖苷酶完全不同。PNGase首先特异性识别并水解糖链还原末端GlcNAc与位点Asn之间羰基与氨基形成的共价键,将Asn水解为Asp；然后,末端为氨基的糖链部分(糖胺)释放,再在溶液中进一步水解去氨基化,形成末端为羟基的糖链。由于PNGase在糖基化修饰研究领域的应用更为广泛,我们曾尝试PNGase催化糖链18O标记的可能性。但研究结果表明,由于去氨基化反应本身是可逆的,即使溶液不含氨,糖胺水解后产生的氨仍会在一定程度上阻止去氨基化的完全发生,溶液中仍会保留大量糖胺。剩余的糖胺在之后的纯化过程当中发生进一步水解,而纯化过程中大量使用的普通H216O会使这部分糖链带上16O,造成相当数量的糖链被标记为16O,无法用于相对定量。本论文通过进一步改变PNGase酶切后溶液的pH值,发现在酸性条件下,糖胺去氨基化可以完全发生,彻底转变为末端为羟基的N-糖链。基于此现象,我们在H218O配置的缓冲溶液中进行PNGase酶切,并将酶切后溶液的pH调至酸性,最终实现了PNGase催化下N-糖链的完全18O标记。在经质谱分析及去卷积修正后,该方法在两个数量级范围内同样表现出良好的线性与重复性。基于此,我们进一步将PNGasr F酶促糖链18O标记、位点18O标记和trypsin酶促肽段18O2标记结合,创造性地发展了18O4标记,在一次实验中同时实现糖链、糖基化位点和糖肽的相对定量。我们将该技术应用于肝细胞肝癌相关血清IgG蛋白的糖基化定量研究,发现了与肝癌相关的IgG糖肽、糖基化位点和N-糖链的定量改变。18O4标记策略实现了糖蛋白质组学与糖组学的一步定量,极大地促进了这两个领域的发展与融合。该部分的研究意义与创新性如下：(1)通过使糖胺彻底水解,首次实现了PNGase酶促N-糖链还原末端180标记反应,标记效率几乎为100%；(2)考察了该标记技术用于糖链相对定量的准确性、线性、重复性,并探讨了该技术与GREOL的互补性；(3)建立了酶促1804标记定量技术,实现一步到位的糖链18O标记、糖基化位点18O标记和肽段18O2标记,用于糖链、糖肽/糖基化位点、非糖肽/蛋白的同时定量；(4)利用18O4标记定量技术对肝细胞肝癌相关血清IgG进行了N-糖基化定量研究,并发现糖肽与糖蛋白水平并未发生明显变化,而糖链却呈现诸多改变,其中双链和含平分型GlcNAc的糖链明显增多,而单链的糖链明显减少,说明蛋白部分与糖链部分的定量改变并不一致,这为进一步的研究和潜在诊断标志物的发现奠定了基础。硼氢化钠辅助的酶促N-糖链18O标记技术与双同位素标记技术：本论文发展了两种酶促糖链18O标记技术,但这些反应仅能在糖链上标记一个18O原子,形成较小的2Da分子量差异,在质谱分析中易造成较为严重的同位素峰重叠现象。虽然该现象可以通过去卷积修正计算最大限度地避免,但这还是增加了定量分析的工作量,并且两组样品需先分别检测后,才能混合检测,由此造成的操作误差也会比较大。除此之外,标记后糖链上的18O仍会同普通水中的16O发生缓慢交换,造成长时间在普通水中储存的标记糖链掺入大量的16O标记,使定量效果大大折扣。为了解决上述问题,本论文进一步发展了硼氢化钠辅助的酶促18O标记技术与’8O+D双标记技术,即在酶促糖链18O标记反应完成后,向反应体系中加入氘代硼氢化钠,使糖链还原末端发生还原,半缩醛断开、加氢,形成糖醇结构,并标记上一个氘原子。而还原后的糖链不再含有还原末端,也不会再同溶液中的氧原子发生任何交换,使18O标记更加稳定。同时,标记的氘原子使两组样品的分子量差异扩大到3Da,大大降低了同位素峰的重叠程度,使糖链酶促定量分析更加简单、可靠。我们通过实验考查了该方法的标记稳定性与同位素峰重叠性,均取得了很好的效果。通过氘代硼氢化钠的辅助标记,我们改进了N-糖链的酶促18O标记技术,进一步推动了该技术在定量糖组学中的广泛应用。该部分的研究意义与创新性如下：(1)通过在糖链酶促16O/18O标记后引入NaBH4/NaBD4,使糖链末端还原为糖醇,并证明了在糖链还原之后,16O/18O标记更加稳定；(2)发现NaBH4/NaBD4处理可在糖链末端引入一个稳定的H/D,使16O/18O标记糖链的质量差异变为3Da,实现了16O+H718O+D双标记技术,避免了同位素峰重叠效应；(3)发展了快速还原、加氢方法,整个处理流程仅需数小时,仅涉及硼氢化钠一种试剂,使糖链酶促18O标记实现改进的同时,该技术简单、快速、高效的优势也得以保留。