猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）引起猪圆环病毒病（Porcine circovirus diseases,PCVD）或猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus associated diseases,PCVAD）。据报道,在我国大多数地区猪群中,PCV2阳性率超过60%。前人的研究已经证实,PCV2感染首先侵害机体的免疫系统,使感染猪对多种病原易感,导致感染猪群的病死率显著升高,生产性能明显下降,造成巨大的经济损失。由于PCV2基因组小和有限的编码能力,其生活周期必须依赖宿主因子。Cap蛋白作为PCV2唯一的结构蛋白,是组装病毒粒子的组份,在病毒和宿主相互作用中发挥非常重要的作用。为了确定Cap蛋白在PCV2感染与致病中的作用,Tim Finsterbusch等人用酵母双杂交方法鉴定出宿主蛋白MKRN1和p32是PCV2 Cap蛋白关键的互作蛋白,但是这两种蛋白在PCV2感染与致病过程中具体作用方式及相应作用机制尚不清楚。本研究首先建立mkrn1和p32基因敲除细胞。然后,用PCV2感染野生型、mkrn1基因敲除PK-15细胞,明确MKRN1通过介导Cap蛋白的泛素化调控机制,从而在PCV2致病过程中发挥作用。用针对MKRN1泛素化Cap位点的PCV2突变毒株感染猪,验证MKRN1在PCV2感染致病过程中的作用及机制。最后,用PCV2感染野生型、p32基因敲除PK-15细胞,明确p32在PCV2出核中的调控作用以及对PCV2复制的影响。旨在进一步阐明PCV2感染致病过程中宿主细胞蛋白MKRN1和p32对PCV2的调控作用与机制。研究取得以下结果。1.根据mkrn1和p32基因组序列分别设计3对靶向mkrn1和p32基因的g RNAs,构建重组慢病毒载体并包装,感染PK-15细胞,48 h后用嘌呤霉素筛选阳性单克隆细胞,获得3株细胞。通过western blotting鉴定其基因表达情况,结果显示,Re-Lenti CRISPR-Sg64感染获得的MKRN1（64）细胞和Re-Lenti CRISPR-Sg266感染获得的MKRN1（266）细胞中未检测到MKRN1表达,而Re-Lenti CRISPR-Sg2211感染获得的MKRN1（2211）细胞中MKRN1表达量与野生型相比没有显著差异;Re-Lenti CRISPR-Sg22感染获得的p32（22）细胞和Re-Lenti CRISPR-Sg155感染获得的p32（155）细胞中未检测到p32表达,而Re-Lenti CRISPR-Sg173感染获得的p32（173）细胞中p32表达量与野生型PK-15细胞相比没有显著差异。通过基因测序鉴定细胞株中目的基因的编辑情况,结果显示,在MKRN1（64）细胞中g RNA64靶向位点处与野生型PK-15细胞基因组相比缺失302 bp的核酸片段,随机插入327 bp的未知序列;在MKRN1（266）细胞中,g RNA266靶向的mkrn1基因处与野生型PK-15细胞基因组相比缺失2个碱基,使得碱基移码突变,突变成终止密码子;在MKRN1（2211）细胞中,g RNA2211靶向的mkrn1基因处与野生型PK-15细胞基因组相比序列没有突变。在p32（22）细胞中,g RNA22靶向的p32基因处与野生型PK-15细胞基因组相比缺失361 bp的核酸片段,插入一段629 bp的未知序列;在p32（155）细胞中,g RNA155靶向的p32基因处与野生型PK-15细胞基因组相比缺失252 bp的核酸片段,插入一段415 bp的未知序列;而在p32（173）细胞中基因组测序结果与野生型PK-15细胞基因组相比没有突变。筛选出来的细胞用CCK-8检测细胞生长活性,结果显示,与野生型PK-15细胞相比均没有显著性差异（p＞0.05）。2.MKRN1表达模式检测结果显示,在PK-15细胞以及ST细胞中,p MKRN1-short是MKRN1的分子表达模式;免疫共沉淀结果显示,MKRN1以及Flag-MKRN1（201-418）与PCV2 Cap蛋白发生了互作;在PCV2感染PK-15细胞后12 h,MKRN1 m RNA和蛋白水平开始显著上升（p＜0.01）,24 hpi达到最高值,48 hpi显著降低（p＜0.05）;过表达p MKRN1能够显著降低Cap蛋白的表达并抑制子代病毒的产生（p＜0.01）;Cap表达载体和p EGFP空载体共转染野生型PK-15细胞、64PKMKRN1-/-,266PKMKRN1-/-和2211PKMKRN1+/+细胞,western blotting结果显示,转染后24 h和48 h,Cap蛋白的表达水平在64PKMKRN1-/-和266PKMKRN1-/-细胞中显著高于野生型PK-15细胞和2211PKMKRN1+/+细胞中Cap蛋白的表达水平（p＜0.01）,PCV2感染后24 h,其Cap蛋白表达量和子代病毒的产生量在敲除细胞中显著高于野生型PK-15细胞和2211PKMKRN1+/+细胞（p＜0.05）;蛋白酶体途径抑制剂（MG132）能够明显抑制MKRN1对Cap蛋白的降解,而溶酶体抑制剂（E64）不能抑制MKRN1对Cap蛋白的降解,并且Cap蛋白的降解依赖于MKRN1介导的Cap多聚泛素化。将突变的MKRN1[MKRN1（H243E）]转入敲除细胞中,不能恢复MKRN1介导的Cap蛋白泛素化;免疫共沉淀结果显示,Cap蛋白与MKRN1的互作区域是aa 108-161和aa 162-198,其中,aa 162-198能够显著被MKRN1降解,突变aa 162-198区域中第164,179和191位赖氨酸能够阻止Cap的泛素化;根据3个位点构建的PCV2突变病毒（PCV2Km A）不能被MKRN1泛素化,其复制能力较野生型PCV2显著升高（p＜0.01）。3.用野生型PCV2及突变毒株PCV2Km A滴鼻感染断奶仔猪,QPCR结果显示,PCV2Km A攻毒组外周血中的病毒含量显著高于野生型PCV2攻毒组外周血中的病毒含量（p＜0.01）;PCV2Km A攻毒猪的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结中的病毒含量显著高于PCV2攻毒组相同组织中的病毒含量（p＜0.01）。免疫组化结果显示,PCV2Km A攻毒组的肺脏和淋巴结中的病毒载量比野生型PCV2攻毒组的病毒载量多;组织病理学检查结果显示,PCV2Km A感染猪间质性肺炎较野生型PCV2感染更为严重;PCV2Km A感染猪淋巴结的淋巴细胞减少症较野生型PCV2感染更为严重。4.PCV2感染p32敲除的PK-15细胞(22PKp32-/-和155PKp32-/-),p32未敲除的PK-15细胞(173PKp32+/+)和野生型PK-15细胞,不同时间点检测病毒滴度,结果显示,感染后36 h,48 h和72 h,22PKp32-/-和155PKp32-/-细胞总的PCV2滴度和细胞培养上清中的PCV2滴度显著低于173PKp32+/+和野生型PK-15细胞中的PCV2滴度（p＜0.05）;22PKp32-/-和155PKp32-/-细胞内的PCV2滴度在感染后48 h和72 h显著降低（p＜0.05）;western blotting结果显示,野生型PK-15细胞和173PKp32+/+中约60%的Cap蛋白分布在胞核中,然而在22PKp32-/-和155PKp32-/-中,约80%的Cap蛋白分布在细胞核;PCV2感染细胞后通过其Cap蛋白诱导p32入核,通过p32募集Cap、lamin A/C和LBR形成复合物,并且p32的存在促进lamin A/C的磷酸化和lamin A/C在细胞核的重分布;PCV2感染PK-15细胞通过诱导PKCδ（T505）磷酸化促进lamin A/C磷酸化和重分布;PCV2感染p32敲除细胞12 h,24 h,36 h,PKCδ（T505）的磷酸化水平约下降50%;激光共聚焦结果显示,在PCV2感染的野生型PK-15细胞和173PKp32+/+细胞中,p-PKCδ分别与p32和Cap可共定位在核膜上,然而在22PKp32-/-细胞中,p-PKCδ与Cap仅能共定位在核质中;此外,在PCV2感染的野生型PK-15细胞和173PKp32+/+细胞,p-PKCδ与lamin A/C共同分布在核膜上,或者在核质呈现相同的点状分布,甚至在某些区域呈现出共定位,而在PCV2感染的22PKp32-/-细胞中,p-PKCδ分布在核质,lamin A/C分布在核膜上;GST-pull down结果也证实PKCδ分别与PCV2 Cap和p32可以直接互作;Co-IP结果和激光共聚焦结果显示,Cap N端aa?24RRR26?是其与p32互作的关键氨基酸,并且突变后的PCV2（PCV2Rm A）滴度显著低于野生型PCV2（p＜0.05）。本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除PK-15细胞中的mkrn1基因和p32基因,获得2株mkrn1基因敲除细胞和2株p32基因敲除细胞。在PCV2感染PK-15细胞过程中,宿主细胞蛋白MKRN1 C端aa 201-418与PCV2 Cap蛋白互作,过表达MKRN1能够显著降低Cap蛋白的表达并抑制子代病毒的产生,在MRKN1敲除的细胞中,Cap蛋白表达量和子代病毒的产生量显著升高;MKRN1发挥其E3连接酶作用,通过泛素化Cap蛋白的164,179和191位赖氨酸促进Cap的多聚泛素化和降解,从而抑制PCV2复制,针对MKRN1泛素化Cap蛋白3个位点的PCV2突变毒株（PCV2Km A）感染断奶仔猪,其在猪体内的复制能力显著高于野生型PCV2毒株,而且造成更加严重的肺脏和淋巴结组织病变。PCV2感染通过p32募集PKCδ到核膜上促进lamin A/C的磷酸化和再分布。突变Cap N端aa?24RRR26?,获得的突变毒株病毒复制能力显著低于野生型PCV2。研究结果阐明了PCV2感染致病过程中宿主细胞蛋白MKRN1和p32对PCV2的调控作用与机制,为进一步研究PCV2的致病机理提供了新的理论数据。