本论文涉及猪戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）和禽HEV两种病毒。两种病毒均属于肝炎病毒科Orthohepevirus属,猪是HEV的主要储存宿主,对猪戊型肝炎的流行情况的研究具有重要的公共卫生学意义。禽HEV引起蛋鸡产蛋量下降、肝脾肿大综合症等,是危害养禽业的重要疫病之一。探索禽HEV与靶细胞之间的相互作用为了解病毒的致病机制提供重要的理论基础。HEV的流行传播是亚洲和非洲等许多发展中国家以及一些工业化国家的重要公共卫生问题。据报道,食用生猪肉和未煮熟猪肉可将HEV传播给人类。因此,HEV在猪群中的传播是重要的公共卫生问题。目前,猪被认为是HEV的主要天然储存宿主。HEV基因3型和4型是引起人畜共感染的主要病毒基因型,近年来基因4型是中国主要流行的HEV毒株,也是中国养猪场流行传播的主要基因型。迄今为止,相关研究人员已在我国人群和猪群中鉴定出6种基因亚型（4a、4b、4d、4g、4h和4i）,并对吉林、广东、浙江、江苏和山东等省以及中国东部地区的猪场进行了HEV的血清学调查和遗传特征鉴定。第一部分陕西省猪场猪HEV感染率调查及猪精液中HEV RNA的检出本研究对陕西省五个城市的多个养猪场猪血清中抗HEV IgG抗体进行了检测,并对流行毒株的基因型进行了鉴定分析。研究结果如下:猪血清中抗HEV IgG抗体检测结果显示,来自17个猪场的7178份猪血清中HEV阳性血清检出率为76.47%（13/17）。HEV血清学检测为阳性的猪场中,血清阳性率介于1.6%至37.5%之间。HEV RNA检测发现在9个猪场共有26份粪样和6份胆汁,并且首次发现了1份精液为HEV RNA阳性。将33个毒株序列进行比对和进化树分析,发现均属于基因4型,并分为三个分支（4d、4h和4i）;同时,以HEV RNA阳性猪精液总RNA为模板,成功扩增到HEV ORF 1和ORF2基因片段（分别为1080 bp和1594bp）。基于两个基因片段的进化树分析,进一步证实该毒株属于4i基因亚型。综上所述,本研究初步阐明了HEV在陕西省养猪场流行传播,其主要基因型为4i,同时也有基因亚型4d和4h。更重要的是,本研究首次发现猪精液中存在HEV RNA。第二部分:禽HEV衣壳蛋白（ORF2）互作蛋白OATP1A2的筛选、鉴定及其在病毒感染中的作用禽HEV是鸡肝炎-脾肿大综合症（HSS）或大肝大脾病（BLSD）的主要病原,引起蛋鸡产蛋率下降和肉种鸡的死淘率升高。由于缺乏有效的实验室模型和体外培养细胞系,我们对禽HEV的生物学及其感染机制了解甚少。2010年,本人所在团队首次鉴定和分离到属于基因3型的中国禽HEV,并获得接近完整的基因组,将该毒株命名为China avian HEV（CaHEV）。之后,本实验室对CaHEV的病原学特点、基因组结构等方面进行了相关研究。CaHEV ORF2编码包括606个氨基酸（aa）的病毒衣壳蛋白,含有病毒颗粒的主要抗原表位。目前,禽HEV ORF2的研究多集中在衣壳蛋白的抗原表位和抗原性的研究上,缺乏对其在病毒感染中的功能研究。本研究参考HEV的相关研究成果,以截短的CaHEV衣壳蛋白为诱饵蛋白,筛选与之结合的鸡肝脏细胞蛋白,并进一步证实了靶蛋白与衣壳蛋白的相互作用,初步探索了一个靶蛋白在HEV的吸附和感染过程中的作用。结果如下:1禽HEV ORF2互作蛋白的筛选与鉴定本研究依据报道的人HEV ORF2截短蛋白p239（aa 368～660）,选择了禽CaHEV ORF2第313位到549位之间的237个氨基酸（aa 313～549）,将其命名为avian HEV protein 237（简称为ap237）。该蛋白包含了重要的抗原表位和已知的一个中和表位（aa476～513）。以原核表达的GST-ap237作为诱饵蛋白,通过GST pull-down和蛋白质谱分析技术,筛选获得与ap237互作的236个肝脏组织蛋白,并对其进行生物信息学分析。以多次跨膜蛋白OATP1A2作为研究对象,利用免疫共沉淀和激光共聚焦试验,验证了OATP1A2与CaHEV衣壳蛋白在293T细胞内的相互作用。将OATP1A2膜外区序列串联(命名为1A2ecto),利用原核表达系统表达的重组蛋白GST-1A2ecto,进行GST pull-down和ELISA分析,验证了ap237与OATP1A2的膜外区的直接结合。2 OATP1A2对禽HEV吸附与感染LMH细胞的影响成功构建了稳定表达OATP1A2-GFP和GFP的LMH1A2-GFP细胞系和LMHGFP细胞系。免疫印迹实验和流式细胞术分析证实OATP1A2的过表达可以促进ap237蛋白吸附LMH细胞。与LMH细胞相比,过表达OATP1A2的LMH1A2-GFP细胞中,病毒的吸附和感染显著增加,而si1A2敲低OATP1A2的表达后,CaHEV的吸附和感染试验显著减少,证实了OATP1A2的表达促进了病毒的吸附和感染。此外,为了验证OATP1A2对病毒吸附和感染影响的特异性,一方面,利用该蛋白的底物（或抑制剂）与LMH1A2-GFP细胞作用,进行病毒的吸附和感染试验,发现这些底物（鹅去氧胆酸,胆酸钠和伊马替尼）或抑制剂（卡维地洛）均可以显著阻断病毒对LMH1A2-GFP细胞的吸附与感染。另一方面,验证了OATP1A2的抗血清和ap237蛋白的处理也可显著阻断禽HEV对LMH1A2-GFP细胞的吸附和感染。免疫组化检测发现OATP1A2蛋白在肝脏、肾脏、睾丸、脑和脊髓中均有表达;检测感染鸡不同组织中OATP1A2 RNA和CaHEV RNA,发现OATP1A2 RNA的相对表达水平较高的肝脏、肾脏、睾丸、脑和脊髓中,CaHEV RNA的含量较高,OATP1A2 RNA的相对表达水平与CaHEV RNA的含量呈正相关。进一步证实了鸡OATP1A2蛋白与禽HEV的感染相关。综上所述,跨膜蛋白OATP1A2直接与CaHEV ORF2蛋白结合,对病毒吸附和感染有显著的促进作用,这种促进作用可以被OATP1A2的底物或抑制剂、OATP1A2抗血清和禽HEV衣壳蛋白特异性的阻断。据此推测OATP1A2是参与禽HEV吸附和感染靶细胞的重要蛋白之一。