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目的:本研究以人单核细胞株THP-1为基础,观察NOD1/RIP2信号通路对巨噬细胞炎性活化以及表型变化的影响,探讨NOD1/RIP2信号通路在动脉粥样硬化形成和发展中的作用机制。方法:分别用不同浓度(10、25、50mg/L)的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激THP-1源性巨噬细胞中24 h,以50 mg/L浓度的ox-LDL分别刺激THP-1源性巨噬细胞(8、16、24 h),以空白组作为对照。应用荧光实时定量PCR检测THP-1源性巨噬细胞中NOD1、RIP2 m RNA表达;应用Western blot检测细胞中NOD1、RIP2蛋白表达;应用ELISA检测细胞肿瘤坏事因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的分泌。设计3对RIP2 si RNA,应用hiperfict转染试剂转染RIP2 si RNA进入细胞。应用荧光实时定量PCR检测THP-1源性巨噬细胞转染后RIP2 m RNA的表达;应用Western blot检测细胞转染后RIP2蛋白的表达,从而筛选最适si RNA转染浓度和最有效的一对si RNA。用最有效RIP2 si RNA转染细胞后,50 mg/L ox-LDL处理24 h。应用ELISA检测TNF-α、MCP-1的分泌;应用流式细胞术检测细胞表面抗原CD86表达;荧光实时定量PCR检测细胞白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素12(IL-12)m RNA的表达。结果:ox-LDL能以剂量依赖和时间依赖的方式诱导巨噬细胞中NOD1/RIP2信号通路的表达,随着ox-LDL刺激浓度的增加,NOD1 m RNA的表达增加(对照组:1±0;10mg/L组:2.32±0.7;25 mg/L组:4.37±1.36;50mg/L组:15.6±1.95,P<0.01);同样RIP2 m RNA的表达也增加(对照组:1±0;10mg/L组:3.45±0.98;25 mg/L组:7.62±0.92;50mg/L组:10.21±1.13,P<0.01);NOD1蛋白和RIP2蛋白的表达也随ox-LDL刺激浓度的增加而增加,分别为NOD1蛋白(对照组:0.14±0.01;10mg/L组:0.30±0.03;25 mg/L组:0.93±0.03;50mg/L组:1.26±0.05,P<0.01);RIP2蛋白(对照组:0.2±0.02;10mg/L组:0.21±0.01;25 mg/L组:0.85±0.07;50mg/L组:1.52±0.09,P<0.01)。随着ox-LDL刺激时间的增加,NOD1 m RNA的表达增加(对照组:1±0;8 h组:7.39±1.59;16 h组:11.2±2.51;24 h组:16.1±3.59,P<0.01);同样RIP2m RNA的表达也增加(对照组:1±0;8 h组:1.46±0.29;16 h组:2.54±0.37;24 h组:4.27±0.69,P<0.01)。NOD1蛋白和RIP2蛋白的相对表达量也随ox-LDL刺激时间的延长而增加,分别为NOD1蛋白(对照组:0.41±0.03;8 h组:1.63±0.12;16 h组:2.27±0.11;24 h组:2.86±0.15,P<0.01);RIP2蛋白(对照组:0.39±0.03;8 h组:1.23±0.14;16 h组:4.42±0.28;24 h组:5.93±0.64,P<0.01)。ELISA结果显示随着ox-LDL刺激浓度的增加,TNF-α(对照组:18.51±0.77 pg/m L;10mg/L组:24.71±2.47 pg/m L;25 mg/L组:30.64±1.96 pg/m L;50mg/L组:71.53±2.35 pg/m L,P<0.01)和MCP-1(对照组:49.11±4.03 pg/m L;10mg/L组:108.5±4.96 pg/m L;25 mg/L组:127.91±4.13 pg/m L;50mg/L组:163.4±7.22pg/m L,P<0.01)的表达升高;随着刺激时间的延长,TNF-α(对照组:18.51±0.77pg/m L;8 h组:27.01±0.95 pg/m L;16 h组:44.71±2.06 pg/m L;24 h组:71.53±2.35 pg/m L,P<0.01)和MCP-1(对照组:49.11±4.03 pg/m L;8 h组:74.51±3.92 pg/m L;16 h组:77.76±7.24 pg/m L;24 h组:163.4±7.22 pg/m L,P<0.01)的表达升高。以不同浓度si RNA转染细胞,荧光实时定量PCR结果显示50 nmol/L的si RNA基因沉默效应最明显(0.22±0.08 vs.1±0,P<0.01)。选取50 nmol/L作为实验浓度,转染3对si RNA,用Western blot法检测各组蛋白表达,选出了最有效的一对si RNA(0.38±0.05 vs.2.22±0.08,P<0.01)。以最有效RIP2 si RNA转染细胞后,ox-LDL处理24 h。ELISA检测结果显示,与对照组相比,50 mg/L ox-LDL刺激组显著增加炎症因子TNF-α和MCP-1的分泌(分别为30.68±1.31 pg/m L vs.12.77±0.68 pg/m L;53.42±2.99 pg/m L vs.18.06±2.11 pg/m L,P均<0.01);与ox-LDL刺激组相比,RIP2 si RNA转染后ox-LDL刺激组炎症因子的分泌显著下降(分别为19.31±1.65 pg/m L vs.30.68±1.31 pg/m L;28.62±0.88 pg/m L vs.53.42±2.99 pg/m L,P均<0.01)。流式细胞术和荧光定量PCR结果显示,与较对照组相比,50 mg/L ox-LDL刺激组表面抗原CD86(7605.74±61.27 vs.11538.47±179.35,P<0.01)、IL-12(0.3±0.07 vs.1±0,P<0.01)的表达减少;IL-10(4.26±0.22 vs.1±0,P<0.01)的表达升高。与ox-LDL刺激组相比,RIP2 si RNA转染后ox-LDL刺激组CD86(7590.99±63.96 vs.7605.74±61.27,P>0.05)、IL-12(0.3±0.07 vs.0.3 1±0.08,P>0.05)、IL-10(4.31±0.28 vs.4.26±0.22,P>0.05)的表达均无明显变化。结论:巨噬细胞中NOD1/RIP2信号通路能被ox-LDL以剂量依赖和时间依赖的方式激活。NOD1/RIP2信号通路可以调控ox-LDL诱导的巨噬细胞的炎性活化,但对ox-LDL诱导的巨噬表型变化没有明显影响。