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研究目标1、探讨高糖附加缺氧对体外培养大鼠心肌微血管内皮细胞(MMEVCs)增殖活力和其凋亡的影响,及红景天苷对其的保护作用。2、通过研究红景天苷对高糖缺氧条件下内皮细胞生长因子受体Flk-1及其下游信号传导通路Akt/eNOS/NO中磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化eNOS(p-eNOS)、 NO表达的影响,探索红景天苷提高MMEVCs增殖活力、抑制其凋亡的作用机制。实验方法1、MMVECs的分离、培养、纯化和鉴定7d龄的Wistar大鼠取其心脏,采用胰蛋白酶预消化后,Ⅱ型胶原酶二次消化获得细胞悬液,密度梯度离心法分离MMVECs,差速贴壁法进行纯化；细胞免疫荧光检测微血管内皮细胞特异性第Ⅷ因子、CD34及CD31相关抗原,对MMVECs进行鉴定；根据CD3,阳性率计算细胞纯度。2、MMVECs高糖缺氧模型的建立纯化后的MMVECs培养至第2代,借鉴以往我们的研究经验,分别用25、50、75、150mmol/L葡萄糖(Glu)培养基作用24、48、72、96h,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法摸索高糖对MMVECs影响的最佳作用浓度和时间。结果以含50mmol/L葡萄糖(Glu)的高糖培养基作用72h影响最为显著,确定为最佳作用条件。分别在高糖处理结束前24h、18h、12h、6h、4h,依次将细胞置于自制的细胞缺氧装置中合并缺氧处理(持续通入体积分数为1%O2、5%CO2和94%N2的缺氧气体),分别设高糖+缺氧24h组、18h组、12h组、6h组和4h组,同时设置50mmol/L高糖对照组；用MTT比色法摸索50mmol/L高糖作用72h条件下MMVECs的最终缺氧作用时间进行实验,建立最适的MMVECs高糖缺氧模型。3、红景天苷对高糖缺氧条件下MMVECs损伤的保护作用及其机制探讨取培养至第2代的MMVECs,分别加入50mmol/L Glu高糖培养基配置的红景天苷(Sal)0.25μg/ml、0.5μg/ml>1μg/ml、2μg/ml、4/μg/ml工作液,培养72h,并在高糖处理结束前12h附加缺氧条件：同时设正常对照组,即用含25mmol/L Glu的培养基常氧培养72h;用MTT比色法检测不同组别细胞活力,选择红景天苷干预MMVECs高糖缺氧损伤的最佳浓度,进行最终试验。用50mmol/L高糖培养基作用72h,结束前12h附加缺氧条件,设红景天苷组(Sal1μg/ml).培哚普利组(PD10μmol/L)和高糖缺氧组：同时设正常对照组；MTT比色实验观察各组MMVECs增殖活力变化,Hoechst33342染色观察各组细胞凋亡的形态学变化,高倍镜下随机选取10个视野计数凋亡细胞,计算凋亡率；用免疫蛋白印迹法(Western Blot)检测各组细胞Flk-1蛋白及Flk-1下游Akt/NOS信号通路中磷酸化蛋白p-Akt和p-eNOS的表达,用硝酸盐还原酶法测定细胞上清液中NO的浓度。实验结果1、原代培养MMVECs,即二次消化法获得细胞后,用密度梯度离心法分离细胞,差速贴壁法纯化细胞,可以得到纯度较高的细胞,细胞免疫荧光鉴定细胞纯度可达到90%以上。2、MTT比色试验：(1) MMVECs高糖缺氧模型的建立确定MMVECs高糖损伤的最佳作用时间和浓度：与正常对照组(25mmol/LGlu)相比,72h开始各浓度组OD值都显著下降(P<0.05或0.01),其中50mmol/LGlu组OD值降低最为显著(P<0.01),说明高糖50mmol/L作用72h条件下细胞增殖活力开始显著降低;MMVECs高糖缺氧模型的建立：与单纯高糖对照组相比,在高糖50mmol/L作用72h条件下,附加缺氧12h、18h、24h,观察发现,缺氧12h OD值开始显著降低,且随缺氧时间延长各组OD值依次降低(P均<0.01)；与高糖+缺氧12h组相比,高糖+缺氧24h组OD值显著降低(P<0.01),提示高糖50mmol/L作用72h条件下,高糖作用结束前12h叠加缺氧处理,细胞增殖活力开始较单独高糖培养显著下降。(2)摸索红景天苷干预MMVECs高糖缺氧损伤的最佳药物浓度与高糖缺氧组相比,红景天苷各浓度处理组OD值均升高,其中红景天苷2μg/ml和4μg/ml处理组OD值升高无显著差异(P均>0.05);红景天苷各浓度处理组间比较,0.5μg/ml和1μg/ml浓度组OD值大于其余各组,差异具有统计学意义(P<0.05或0.01),但1μg/ml处理组和0.5μg/ml组OD值差异无统计学意义(P>0.05)；与正常对照组相比,1μg/ml处理组OD值降低,但无显著差异(P>0.05)。提示1μg/ml红景天苷浓度组显著促进高糖缺氧条件下MMVECs的增殖。(3)比较红景天苷与培哚普利干预高糖缺氧条件下MMVECs的增殖活力与正常组相比,红景天苷组(Sal1μg/ml)、培哚普利组(PD10μmol/L)和高糖缺氧组OD值均降低(P均<0.05)：与高糖缺氧组相比,红景天苷组和培哚普利组OD明显增加,具有显著性差异(P均<0.05)；与培哚普利组相比,红景天苷组OD值无显著性差异(P>0.05),提示红景天苷可以促进高糖缺氧条件下MMVECs的增殖,其作用效果与培哚普利相近。3、Hoechst33342染色检测各组细胞凋亡：与正常对照组相比,高糖缺氧组细胞核出现核固缩、核碎裂和蓝色浓染等典型的细胞凋亡形态学变化,红景天苷组(高糖缺氧+Sal1μg/ml)和培哚普利组(高糖缺氧+PD10μmol/L)细胞核浓染变淡,核固缩和核碎裂减少;正常对照组细胞凋亡率为(1.3±0.3)%,红景天苷组为(15.6±1.8)%;与红景天苷组相比,培哚普利组(17.2±1.5)%及高糖缺氧组(26.5±1.8)%的细胞凋亡率显著升高(P均<0.05),提示红景天苷可以抑制高糖缺氧引起的MMVECs凋亡。4、Western Blot检测Flk-1、p-Akt和p-eNOS表达：与正常对照组相比,高糖缺氧组、红景天苷组和培哚普利组Flk-1、和p-eNOS表达均显著降低(P均<0.05),其中红景天苷组p-Akt表达水平降低无统计学意义(P>0.05)；与高糖缺氧组相比,红景天苷组和培哚普利组Flk-1、p-Akt和p-eNOS表达均显著增加(P均<0.05)；与红景天苷组比较,培哚普利组Flk-1表达降低,但无显著差异(P>0.05),p-Akt表达降低、p-eNOS表达升高,差异均具有有统计学意义(P均<0.05)。提示红景天苷可以提高高糖缺氧导致的Flk-1、p-Akt和p-eNOS蛋白表达降低,其作用与培哚普利组相似。5、硝酸盐还原酶法检测细胞上清中NO浓度：与正常对照组相比,红景天苷组、高糖缺氧组和培哚普利组细胞上清液中NO浓度均降低(P均<0.05);与高糖缺氧组比较,培哚普利组和红景天苷组NO浓度均升高(P均<0.05);而培哚普利组NO浓度高于红景天苷组,差异有显著性(P<0.05),提示红景天苷可以改善高糖缺氧条件下MMVECs NO的生成减少,发挥对MMVECs的保护作用,但作用略逊于培哚普利组。实验结论1、成功培养出纯度较高的MMVECs.2、50mmol/L Glu作用72h为高糖最适作用条件,在此高糖损伤模型基础上附加缺氧对MMVECs的活性有明显的抑制作用,其中高糖作用结束前12h附加缺氧处理细胞增殖活力开始较单纯高糖作用显著降低,因此以高糖50mmol/L作用72h叠加缺氧12h建立MMVECs高糖缺氧模型。高糖缺氧处理同时多个红景天苷浓度干预均可以提高MMVECs高糖缺氧模型细胞的活性,但以红景天苷1μg/ml干预组作用最显著。3、高糖缺氧条件下,MMVECs增殖活力降低,细胞凋亡增加,红景天苷1μg/ml组能提高细胞增殖活力,抑制细胞凋亡。4、高糖缺氧条件下,MMVECs Flk-1蛋白表达下调,Akt和eNOS磷酸化蛋白表达降低,细胞上清液中NO表达降低；红景天苷能促进Flk-1、p-Akt和p-eNOS表达,提高细胞上清液中NO的浓度,提示红景天苷促进高糖缺氧条件下MMVECs增殖,抑制其凋亡可能与红景天苷提高促血管新生受体Flk-1表达及促进该受体下游信号通路Akt/eNOS中蛋白Akt和eNOS的磷酸化,促进其终产物NO合成有关。创新点糖尿病微血管病变的研究主要集中在糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病,对于糖尿病心肌微血管病变研究较少。MMVECs为研究糖尿病心肌微血管病变的细胞模型,本研究采用中药单体红景天苷干预高糖叠加缺氧条件下培养的MMVECs,通过观察红景天苷对MMVECs血管内皮生长因子受体Flk-1蛋白表达及其下游Akt/eNOS通路蛋白磷酸化的作用,研究红景天苷改善大鼠MMVECs在高糖缺氧条件下增殖障碍的机制。采用红景天苷进行的该类研究至今尚未见报道,是本课题的创新点所在,为临床上应用红景天防治糖尿病心血管并发症提供了实验依据。