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第一部分水源MC-LR高效液相色谱检测方法的建立及其在广西肝癌高发区污染情况的初步调查目的建立一种测定水源中MC-LR的高效液相色谱(HPLC)方法,并调查2017年5月和10月广西肝癌高发区不同水源中MC-LR污染情况。方法1.取500 mL水样,0.45μm有机滤膜过滤,滤液过C18柱,依次用10 mL超纯水,20 mL 20%甲醇淋洗,15 mL 80%甲醇(加入0.05%三氟乙酸)洗脱,蒸发浓缩吹干,溶于1 mL超纯水,待测。采用色谱柱,流动相为0.1%磷酸水溶液-乙腈(67:33),流速1.0 mL/min,柱温为45℃,用238 nm波长的紫外线检测水样中微囊藻毒素含量,比较不同条件下微囊藻毒素的回收率和检测限,优化水源水中MC-LR的高效液相色谱法。2.采集2017年5月和10月广西肝癌高发区扶绥县28个村的水源水、末梢水、池塘水各1瓶(500 mL),置于4℃避光保存沉淀后,24 h内过滤、萃取、浓缩和定容到1 mL,采用上述经优化的HPLC检测方法,检测并比较不同水源中微囊藻毒素的含量。结果1.比较经不同浓度的淋洗液处理的微囊藻毒素HPLC检测结果,本研究发现,对于水样定量检测,20%的甲醇淋洗液较为合适。80%甲醇溶液洗脱液中加入0.05%TFA能够明显提高毒素的回收率。流动相为0.1%磷酸水溶液-乙腈(67:33),MC-LR在0.05～1.0 μg/mL范围内线性良好(r2=0.9987),且峰形好;回收率均在90%～110%之间,相对标准偏差为5.4%～9.6%;MC-LR方法检出限分别为0.028μg/L;MC-LR保留时间为15.291 min。2.2017年5月和10月分别采集到广西肝癌高发区不同水源水样57份,其中水源水分别15份,5月和10月份TMCs浓度范围分别为0～169.21 ng/L和6.14～168.56ng/L;末梢水分别28份,5月和10月份TMCs浓度范围为0～617.02 ng/L和0～89.97 ng/L;池塘水分别14份,5月和10月份TMCs浓度范围为0～567.32 ng/L和1.84～897.26 ng/L。比较三种类型的水样5月份和10月份的TMCs平均浓度,其差异有统计学意义(P<0.05)。所有水样的TMCs平均浓度均低于WHO推荐值(1μg/L)。结论经本研究优化的水源中MC-LR的高效液相色谱检测方法的准确度、灵敏度和回收率高,重现性好,可用于水样MC-LR检测;2017年5月和10月广西肝癌高发区扶绥县不同水源中TMCs检出值均低于WHO推荐值(1μg/L)。第二部分 MC-LR与C端截短HBX对HepG2细胞的协同效应及其对PP2A介导的MAPK信号通路下游靶点的影响目的明确MC-LR与C端截短HBX的协同效应,探讨其对PP2A介导的MAPK信号通路下游靶点的影响,阐明MC-LR与HBX在HepG2细胞增殖、侵袭、迁移、周期和凋亡中所起的作用和可能的机制。方法以肝癌组织中HBX常见的整合片段HBXA32、HBXΔ4和野生型HBX为目的片段,分别构建慢病毒载体并转染HepG2细胞。以转染HBXA32、HBXΔ4、HBX后的HepG2细胞加MC-LR为实验组,未转染HBX片段的HepG2细胞加MC-LR和空白对照(NC)为对照组。采用qRT-PCR和蛋白质印迹法(WB)的方法分别检测转染后的各组细胞HBX基因和蛋白的表达情况,判断转染是否成功。在实验组和对照组中,采用酶联免疫吸附法检测PP2A酶活性;采用细胞划痕实验、Transwell小室实验、平板克隆形成实验检测HepG2细胞增殖、迁移及侵袭能力;采用流式细胞术检测HepG2细胞周期和凋亡;采用WB检测PP2A介导的下游MAPK信号通路MEK1/2、ERK1/2、p38和JNK蛋白的表达水平,并进一步检测细胞周期调节蛋白p53,cdc25,cdc2的水平,及使用PP2A蛋白磷酸酶激动剂(DES)干预后,观察这些细胞周期调节蛋白表达水平的改变。结果1.本研究成功构建了表达C端截短HBX基因和蛋白的HepG2细胞,镜下可观察到绿色荧光信号,经qRT-PCR和WB验证有HBX mRNA和蛋白的表达。2.通过比较不同MC-LR浓度梯度和不同干预时间点的PP2A酶活性,发现用10μM MC-LR干预24 h时PP2A酶活性最低。据此选择0和10μM两个MC-LR浓度进行后续的细胞划痕、迁移和侵袭、细胞克隆实验和流式细胞术检测周期和凋亡的实验,并在0和24 h两个时间点观察两者对HepG2细胞的协同效应。选取MC-LR(0、10μM)与HBXΔ32在PP2A酶活性抑制最明显的两个时间点(12 h、24 h),检测PP2A介导的MAPK通路下游相关蛋白的表达水平。3.应用10μM MC-LR干预转染了 HBXΔ4、HBXΔ32 和HBX的 HepG2细胞,结果显示伤口愈合距离、细胞增殖、迁移及侵袭能力明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.应用10μM MC-LR干预转染了HBXΔ4和HBXΔ32的HepG2细胞,发现S期的分布比率较对照组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);比较MC-LR与C端截短HBX对HepG2细胞调亡的影响,结果显示实验组和对照组之间细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。5.比较MAPK信号通路相关蛋白MEK1/2,ERK1/2,p38,JNK蛋白的磷酸化水平,结果显示实验组高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);并且蛋白表达水平随着MC-LR暴露时间延长而增加,两者呈线性相关。6.实验组细胞周期调节蛋白p53,cdc2蛋白的磷酸化与对照组相比表达明显降低,并且随着MC-LR暴露时间延长呈现出依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05)。磷酸化的cdc25蛋白,与对照组相比表达明显升高,并且随着MC-LR暴露时间延长呈现出依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05)。7.用10 PP2A蛋白磷酸酶的激动剂DES预处理HepG2细胞12 h后,p53、cdc25和cdc2在MC-LR+DES处理组的表达比MC-LR处理组的下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论MC-LR与C端截短的HBXΔ32、HBXΔ4和HBX对人肝癌HepG2细胞的增殖、侵袭、迁移能力和细胞周期均有一定的影响;MC-LR与C端截短的HBXΔ32能产生协同作用,增加了 MAPK三条下游通路p38、ERK和JNK中关键蛋白的表达水平;MC-LR与C端截短的HBXΔ32能够通过PP2A引起细胞周期相关的蛋白p53、cdc25和cdc2的磷酸化蛋白水平的改变。表明MC-LR与C端截短的暴露于HepG2细胞后,MAPK激酶很可能是PP2A活性被抑制后的下游靶点,并通过调节MAPK通路下游相应靶点的蛋白磷酸化水平影响HepG2细胞的增殖、侵袭和迁移能力。