论文部分内容阅读
目的:1.通过对子宫内膜异位症病名、病因病机及治法的相关文献研究,探讨隔药饼灸与子宫内膜异位症及miRNA之间的关系。2.研究小鼠子宫内膜组织中差异表达microRNA,寻找差异表达基因与子宫内膜异位症之间的关系。从分子生物学角度寻找可能参与调控的靶基因,初步了解参与内异症调控的特异性mi RNA调控机理。3.研究隔药饼灸的microRNA差异表达的生物分子机制,观测隔药饼灸治疗后子宫内膜异位症在治疗前后的microRNA表达水平的变化,探讨隔药饼灸治疗作用机制与microRNA的关系,从microRNA层面探讨隔药饼灸治疗EMs的作用靶点。探讨隔药饼灸治疗EMs的作用机制,为隔药饼灸治疗EMs提供客观的实验依据。方法:通过知网、万方等数据库检索,进行文献研究,讨论子宫内膜异位症的治法治则和隔药饼灸的作用机理。选用6-8周龄雌性SCID小鼠42只,体重15-20g,分为空白组、模型组、艾灸组、西药组和艾灸加西药组五组。除空白组8只外,其余34只小鼠采用自体移植法制备EMs小鼠模型,造模七天后随机处死两只EMs模型小鼠观察造模是否成功。造模14天后:隔药饼灸组小鼠固定后,在关元穴进行隔药饼灸,每穴灸4壮,持续时间约10分钟,1次/天,连续14天。西药组小鼠给予灌胃Danazol混悬液(每日以36 mg/kg体质量给药),1次/天,连续14天。隔药饼+西药组小鼠先予以Danazol混悬液灌胃,后在关元穴隔药饼灸,1次/天,连续14天。正常组和模型组均给予等容积的生理盐水灌胃,1次/天,连续给药14天。治疗第八天起,每天治疗后一个小时后,各组分别注射缩宫素注射液(36 mg/kg),观察30min内小鼠的扭体反应次数,连续七天。在末次治疗之后24h,小鼠用10%水合氯醛溶液进行麻醉,开腹找到子宫内膜组织(空白组)、异位生长的内膜组织(造模的其余四组)后,用眼科剪剪下子宫内膜组织,放入PBS缓冲液清洗干净并用滤纸吸干,封存放进冰箱,送检。指标检测:1.采用高通量测序方法分析各组的差异表microRNAs,对差异表达的miRNAs利用多种生物信息学软件预测其下游靶基因,进而运用GO,KEGG等软件对其潜在的下游调控通路进行富集和筛选出差异表达microRNAs。2.荧光定量PCR验证:在mi RNA测序预测和筛选结果的基础上,基于基因数据库,运用实时定量RT-PCR对血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达进行检测。Western Blot法:检测五组子宫内膜组织中的P38MAPK、ERK1/2的蛋白表达;3.分析miRNA表达差异及意义,寻找可能隔药饼灸参与调控子宫内膜异位症的miRNA。结果:1.子宫内膜异位症是以“瘀”为主的妇科疾病,法宜活血化瘀、调理冲任,隔药饼灸治疗子宫内膜异位症具有独特优势,具有良好的镇痛效果。2.高通量测序差异microRNA表达:(1)空白组与模型组比较,筛选出66条差异表达microRNA(P<0.05),其中上调31条,下调35条,其中下调基因主要有mi R-21a-5p;mi R-223-3p,mi R-142a-3p,mi R-132-3p,mi R-146b-5p;上调基因主要有mi R-200b-5p,mi R-200a-5p,mi R-200b-3p,mi R-429-3p,mi R-676-5p。(2)隔药饼灸和模型组比较,筛选出4条差异表达的microRNA,0条上调,4条下调(P<0.05)分别为:miR-6538,miR-3470a,miR-2137,miR-5126。(3)西药组与隔药饼灸组比较,筛选出13条差异表达的microRNA,其中4条上调,9条下调(P<0.05)下调mmu-miR-499-5p,miR-133b-3p,miR-496a-3p,miR-206-3p,mi R-21a-5p,miR-3473b,miR-493-5p,miR-133a-3p,miR-487b-3p。上调:miR-183-5p,miR-205-5p,miR-181a-2-3p,miR-183-6p。(4)西药组与模型组比较,筛选出25条差异表达的microRNA,其中7条上调,18条下调(P<0.05)上调基因主要有:miR-195a-3p,miR-615-3p,miR-708-3p,miR-296-3p,miR-671-3p,miR-298-5p,miR-181a-2-3p;下调基因主要有:miR-21a-5p,miR-3473b,miR-483-3p,miR-6240,miR-3963。(5)西药加隔药饼灸组与隔药饼灸组比较筛选出1条差异表达的microRNA,其中0条上调,1条下调(P<0.05):miR-6901-3p。3、采用荧光定量PCR技术及Western blot验证,与mi RNA高通量测序结果一致。下调基因8个:miR-677-5p、miR-6240、miR-132-3p、miR-21a-5p、miR-21a-6p、miR-212-3p、miR-34a-5p、miR-486a-3p,上调基因2个:miR-195a-3p、miR-298-5p,与VEGF的PCR上调下调结果呈负相关。荧光定量PCR验证VEGF的蛋白表达量与测序结果一致,Western blot结果显示,ERK1/2在正常子宫内膜组织中的蛋白表达含量高于异位子宫内膜组织(P<0.01),隔药饼灸干预后ERK1/2的蛋白含量明显低于对照组(P<0.01),隔药饼灸加西药组较对照组ERK1/2蛋白含量减少(P<0.01),西药组与对照组相比ERK1/2蛋白含量减少(P<0.05)。结论:1.隔药饼灸具有缓解EMs疼痛症状的作用,联合达那唑镇痛效果更好。2.隔药饼灸干预可能参与调控差异表达microRNA。3.PCR验证与基因测序结果一致,因此推断这些上调下调的基因可能参与血管内皮因子调控子宫内膜细胞的生长凋亡,其差异mi RNAs的表达可能是EMs发生的重要机制。