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背景和目的由于肥胖、缺乏运动和不合理饮食,2型糖尿病发病越来越年轻化。每5个女性糖尿病患者中就有2个是育龄期女性。每7例活产中就有1例孕妇患有妊娠糖尿病(Gestational diabetes mellitus,GDM)。妊娠期高血糖多伴随孕妇肥胖,不仅增加孕妇未来罹患2型糖尿病的风险,同时也会对胎儿造成多种不良结局,除了近期不良影响,如胎儿畸形、胎儿高胰岛素血症、新生儿呼吸窘迫综合征等,这些GDM孕妇的后代发生肥胖和糖代谢异常的风险显著增加。这些不良结局大多是由母体在妊娠和/或哺乳期间糖代谢异常诱导的,但目前仍不清楚糖代谢异常是通过何种方式实现了母子代间的“遗传”。肠道菌群的母婴传递为解答这一问题提供了新的思路。研究表明,婴儿肠道菌群在母体子宫内就开始形成并主要受分娩方式和哺乳方式的影响。自然分娩过程中婴儿通过母体产道使母体将阴道微生物垂直传递给婴儿,而剖腹产阻断了这一传播途径。在随后的哺乳期间,母乳中天然存在的葡萄球菌、链球菌、微球菌、乳酸菌和肠球菌等菌群可以通过母乳喂养从母体流入婴儿并参与婴儿肠道菌群的建立和演变。据此,本研究通过母代孕前期、孕期及哺乳期高脂饮食诱导母代糖代谢异常,探讨母代糖代谢异常对子代糖代谢和胰岛功能的影响。并通过剖腹产和交叉哺乳阻断母子菌群经阴道和哺乳传递,验证肠道菌群是否介导母代高脂饮食对子代糖代谢和胰岛功能异常的发生发展。方法1.动物模型构建7周龄雌性C57BL/6J小鼠110只,适应性喂养1周后,按随机数字表法随机分为2组,分别给予高脂饮食(HFD组,含60%脂肪,每克热量5.24 kcal)及正常饮食(NCD组,含11.4%脂肪,每克热量3.90kcal)。饮食干预8周后,分别对两组小鼠行口服糖耐量实验,验证是否出现糖代谢异常。将两组雌性小鼠与同周龄正常饮食、正常活动雄性小鼠同笼放置,进行交配,以观察到阴栓之日作为妊娠第0.5天,孕期和哺乳期均自由饮食水,维持相应组别饮食,两组子代分别为高脂饮食组子代(HF/VD/HF组)、正常饮食组子代(NC/VD/NC组)。进一步,采用不同分娩方式(自然分娩或剖腹产)、不同哺乳方式(自行哺乳或交叉组别哺乳)将子代分为:宫内高脂-剖腹产-高脂母乳组子代(HF/CS/HF组),宫内正常-剖腹产-正常母乳组子代(NC/CS/NC组),宫内高脂-自然分娩-正常母乳组子代(HF/VD/NC组),宫内正常-自然分娩-高脂母乳组子代(NC/VD/HF组),宫内高脂-剖腹产-正常母乳组子代(HF/CS/NC组),宫内正常-剖腹产-高脂母乳组子代(NC/CS/HF组)。剔除极低和极高体重者,每组取10只子代进行研究。子代3周龄时断乳,正常饮食喂养至8周龄。2.体重、糖耐量和胰岛素耐量实验在母代孕前期、孕期和哺乳期,子代出生、4周龄、8周龄期间每周监测体重、进食和饮水量。在子代4周龄和8周龄时行口服葡萄糖耐量实验,检测各时间点血糖值。在子代4周龄和8周龄时行腹腔胰岛素耐量实验,检测各时间点血糖值。3.离体胰岛功能检测和胰岛β细胞特异性转录因子检测在子代8周龄时取胰腺组织,分离纯化内分泌部胰岛,体外培养24小时后,行葡萄糖刺激胰岛素分泌功能实验,检测离体胰岛在基础状态(葡萄糖浓度为3.3mmol/L)和高糖刺激状态(葡萄糖浓度为16.7mmol/L)下的胰岛功能。行实时荧光定量PCR检测胰岛β细胞特异性转录因子Pdx-1、MafA mRNA表达水平。4.肠道菌群16S rRNA测序收集母代孕前期、孕期和哺乳期和各组子代4周龄和8周龄时的粪便样本,分别行16S rRNA测序,对测序数据进行生物信息学分析,比较各组子代间肠道菌群的差异、各组子代与其对应母代菌群的差异。5.SPSS 24.0统计软件对实验结果进行数据分析。结果1.高脂饮食造成母代体重明显增加(P<0.05),空腹血糖和空腹胰岛素明显升高(P<0.05),葡萄糖耐量受损(各点血糖值:P均<0.05)。2.高脂饮食组子代体重、糖耐量血糖值均明显高于正常饮食组子代(P<0.05)。高脂饮食组子代胰岛素耐量受损(P<0.05),离体胰岛分泌功能下降(P<0.05),Pdx-1、MafAmRNA表达量降低(P<0.05)。高脂饮食组子代和正常饮食组子代菌群结构差异显著,且子代菌群与相应组别母代菌群分布相近。3.通过剖腹产阻断母子菌群经阴道传递后,经剖腹产出生的高脂饮食组子代胰岛素抵抗有所减轻(P<0.05),离体胰岛分泌功能有所改善(P<0.05),Pdx-1 mRNA表达量有所增加(P<0.05)。该组子代菌群结构与未经阻断的高脂饮食组子代菌群结构存在差异。经剖腹产出生的正常饮食组子代仅表现出轻微胰岛素抵抗(P<0.05)。4周龄时该组子代菌群结构与未经阻断的正常饮食组子代菌群结构存在差异,但8周龄时差异已区分不明显。4.通过交叉哺乳阻断母子菌群经哺乳传递后,接受正常母乳的高脂饮食组子代糖耐量和胰岛素抵抗得到改善(P<0.05),离体胰岛分泌功能改善(P<0.05),Pdx-1 mRNA表达量增加(P<0.05)。该组子代菌群结构与未经阻断的高脂饮食组子代菌群结构存在显著差异且和正常饮食组母代更加接近。接受高脂母乳的正常饮食组子代糖耐量略有升高(P<0.05),出现轻微胰岛素抵抗(P<0.05)。该组子代菌群结构与未经阻断的正常饮食组子代菌群结构存在显著差异。5.通过剖腹产和交叉哺乳同时阻断母子菌群经阴道和哺乳传递后,经剖腹产出生且接受正常母乳的高脂饮食组子代各项指标均接近正常饮食组子代,表现为糖耐量进一步降低(P<0.05),胰岛素抵抗明显减轻(P<0.05),离体胰岛分泌功能明显恢复(P<0.05),Pdx-1 mRNA表达量进一步增加(P<0.05)。该组子代菌群结构与未经阻断的高脂饮食组子代菌群结构存在显著差异,更接近正常饮食组子代菌群结构,且和正常饮食组母代更加接近。经剖腹产出生且接受高脂母乳的正常饮食组子代糖耐量升高并出现胰岛素抵抗(P<0.05),离体胰岛分泌功能略降低(P>0.05),Pdx-1 mRNA表达量降低(P<0.05)。该组子代菌群结构与未经阻断的正常饮食组子代菌群结构存在明显差异,且更接近高脂饮食组子代菌群结构。6.剖腹产联合交叉哺乳对于子代肠道菌群影响最大,其次为单纯交叉哺乳,剖腹产对于子代肠道菌群影响相对最小。以Bifidobacterium属、Lactobacillus murinus属、Muribaculaceae科为代表的5个共丰度基因群在4周龄时在正常饮食组子代和高脂饮食组子代中均体现出显著差异,交叉哺乳后,这些基因群的丰度均发生显著变化。同时,以Bifidobacterium属为代表的基因群在4周龄和8周龄时在正常饮食组子代中都显著高于高脂饮食组子代,剖腹产和交叉哺乳均使正常饮食组子代中Bifidobacterium属的丰度显著降低。结论剖腹产及交叉哺乳可改善母代高脂饮食诱导的子代糖代谢和胰岛功能异常,其发挥作用的关键途径可能是阻断代谢失调的肠道菌群经阴道和哺乳垂直传递。