脂多糖(LPS)是革兰阴性菌(GNB)细胞壁的主要成份，是GNB脓毒症多种病理生理反应的第一触发因子。其引起的脓毒症和脓毒性休克是严重危及生命的全身性炎性反应综合征，表现为血压过低、组织灌流不充分和多器官衰竭，致死率在儿童中为10～15％，在成年人中高达40％左右。既往普遍认为“早期”致炎细胞因子是引起机体失控性炎症反应与组织损害的关键介质，近年的研究发现，高迁移率族蛋白1(HMGB1)可能作为新的“晚期”炎症因子参与了脂多糖的致病过程。深入了解和研究HMGB1的生物学功能及其在脓毒症中的作用，有助于从一个新的角度认识脓毒症和多器官功能障碍综合征(MODS)的发病机制与临床意义，并为探索其防治方法提供新的思路。为此本课题研究的主要内容为：进行人高迁移率族蛋白1基因的克隆和原核表达，对表达的产物进行纯化和活性鉴定，再对人高迁移率族蛋白1的生物学功能进行初步研究。 一、人高迁移率族蛋白1基因的克隆和原核表达：通过RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增出HMGB1的编码基因，克隆于载体pGEM-T easy，测序分析后亚克隆于表达载体pGEX-4T-2，构建人HMGB1编码基因的表达载体，测序证实序列正确后转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导4h后可表达相对分子质量约为56kD的融合蛋白GST-HMG1，表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测，占菌体总蛋白的23％。 第四用医大学硕士学位论文一 二、表达产物的纯化和活性鉴定：融合蛋白 GST－IUviGI用 GSTmp FF蛋白纯化柱纯化，再用凝血酶酶切，获得了相对分子质量约为30kD的纯化蛋白产物，用 Balb儿雄性小鼠经尾静脉注射 sing／Kg HMGBI，注射后 sh观察其肝脏J脏等组织的病理变化；用终浓度为 0刀．ig加J．0 g砌J0 m／ml重组 HMGB与人单核／巨噬细胞系 THP共同培养，6h后观察该细胞分泌TN’F－a的情况。结果重组HMGBI能引起Bath／c ’J’鼠肝脏、肺脏等组织的炎性病理损伤并能刺激 THP细胞 TNF－a的分泌。 三、重组 HMGBI对人单核／巨噬细胞系 THPI的作用研究：HMGBI的剂量效应组分别用含有 0．1、1．0、10、20、50us／ml HMGBI的 RPMI 1640完全培养基与人 THP细胞共培养 6小时，分别收取 HMGB刺激孔及对照孔细胞培养上清，5000 pm离心后收集上清。HMGB的时间效应组以含有20 g／ml HMGBI的培养基、对照组以不含HMGBI的培养基、另外HMGBI与 LPS混合组以含有 20pm／ml HMGBI和 100urn／ml LPS的培养基分别培养THPI细胞 0、Zh、4h、6h、sh、10h、12h、24h，同上收集培养液上清，用双抗体夹心 ELISA法测其上清中的 TNF－a含量。另分别收集 HMGB的剂量效应组终浓度为 0．lin砌、50 m加 的两孔细胞，一部分利用流式细胞 仪分析细胞凋亡情况。其余细胞用DNA裂解液提取其DNA，琼脂糖凝胶电泳 观察结果。结果发现将HMGBI加入到单核／巨噬细胞培养体系中能明显刺 激其T肝七的分泌，在0．150收加范围内，IDAGBI诱导THPI细胞M亿 的分泌增加，呈显著的剂量依赖性关系。实验证实，50 g加1的HMGBI能 明显诱导THP细胞的凋亡，并有典型的DNA梯状带出现；HMGBI组和 HMGB与LPS的混合组THPI细胞TN’Fo的分泌在0飞4h间呈双相性规律。 综上所述，本研究初步证实 HMGB在脓毒症的发生、发展中发挥着 重要作用，对进一步研究该蛋白的生物学功能及其单抗的制备具有重要意义。