葡萄白粉病是危害世界葡萄生产的主要真菌病害,起源于北美洲,目前该病的分布范围已经遍及全世界,而且目前世界上主栽的品质优良的欧洲葡萄品种绝大多数不抗该病,因此,该病对世界的葡萄生产造成了严重的经济损失。我国是葡萄属植物的重要原产地之一,而且我国的野生葡萄对真菌病害具有较强的抗性。随着现代生物技术的高速发展,利用基因工程手段可将抗病基因直接导入感病品种,从而育成抗病性明显提高而原有的经济性状不发生分离的转基因新品种,克服了传统方法的缺点。在转基因之前,有必要在体外对目的基因的表达特性及功能进行相应的分析,从而为转基因植株的检测、安全性评价奠定基础。本研究的目的旨在体外对葡萄抗白粉病相关基因-抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因进行相应的研究。根据已克隆的中国葡萄属野生种抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因序列设计并合成特异性PCR引物,以华东葡萄白河-35-1的cDNA第一链为模板,通过PCR扩增获得APX基因,并进一步将之克隆在中间载体pGEM-T easy上。用限制性内切核酸酶从中间载体上切下目的基因,将之插入到表达载体pGEX-4T-1上获得重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21并用IPTG进行诱导,得到GST-APX融合蛋白,其表达量占菌体总蛋白的35%,且以可溶和包涵体两种形式存在。可溶性蛋白经GST亲和树脂纯化后可得到高纯度的目的蛋白。融合蛋白作为抗原免疫家兔制备得到多克隆抗体。本实验取得如下研究结果1成功地将扩增得到的目的基因APX基因与克隆载体pGEM-T easy连接并转化到宿主菌DH5α中,构建了重组克隆载体pGEM-T/APX。2从克隆载体上切下目的基因与原核表达载体pGEX-4T-1相连,构建了APX的原核表达载体pGEX-4T-1/APX,根据序列分析表明,目的基因按正确的阅读框架插入到表达载体中。筛选出阳性重组体,用IPTG诱导,表达的蛋白产物通过12% SDS-PAGE分析,证明APX基因在大肠杆菌中成功的得到了表达,表达产物的分子量约为55kDa.