论文部分内容阅读
腹泻性肠道炎症作为规模化养殖中最常见的疾病,严重制约生猪养殖业的发展。已有的研究先后证实了血管紧张素转化酶2（ACE2）在抑制肠道炎症,协调肠道物质转运及维护肠道健康方面具有积极影响。研究选取腹泻保育猪和猪肠上皮细胞（IPEC-J2）作为研究对象,探究ACE2在猪肠道炎症变化中的作用及对肠道物质转运影响的相关机制。研究包括以下两个部分:1血管紧张素转化酶2（ACE2）在腹泻保育猪肠道炎性损伤中的变化及对物质转运的影响实验以腹泻保育猪为研究对象,通过分离血清,截取十二指肠、空肠、回肠和结肠等组织样品,进行如下实验:1)测定血液中游离氨基酸及葡萄糖的含量;2)制作病理组织切片,观察各肠段组织病理学变化;3)ELISA法检测各肠段组织中TNF-α、IL-8、IL-10 及 Ang Ⅱ、Ang（1-7）的含量;4)RT-qPCR 分析各肠段组织中 ACE2、MasR 及 B0AT1、SGLT-1、GLUT-2、PEPT-1 等蛋白 mRNA 的表达;5)Western blot检测ACE2、MasR及ACE、AT1R蛋白表达水平。结果:与正常保育猪相比1)腹泻保育猪血液中葡萄糖水平极显著降低（6.03±0.05 vs 4.39±0.04,P<0.01）,总氨基酸含量极显著下降（137.38±1.07vs 97.77±0.53,P<0.01）;2)腹泻保育猪各肠段组织中均有黏膜上皮细胞坏死脱落,肠腺细胞增生等不同程度的病变;3)腹泻保育猪各肠段组织中促炎性因子TNF-α、IL-8含量极显著升高（P<0.01）,抗炎性因子IL-10含量极显著降低（P<0.01）;十二指肠和结肠组织中Ang Ⅱ含量极显著升高（P<0.01）,Ang（1-7）含量降低但不显著;空肠和回肠组织中Ang Ⅱ含量显著升高（P<0.05）,Ang（1-7）含量显著降低（P<0.05）;4)腹泻保育猪十二指肠ACE2mRNA水平显著下调（P<0.05）,MasR、B0AT1、SGLT-1、GLUT-2 及 PEPT-1 的 mRNA 水平极显著下调（P<0.01）;空肠ACE2、MasR的mRNA水平极显著下调（P<0.01）,B0AT1、GLUT-2、PEPT-1的mRNA水平显著下调（P<0.05）,SGLT-1 mRNA水平下调不明显;回肠 ACE2、MasR、B0AT1、SGLT-1、GLUT-2 及 PEPT-1 的 mRNA 水平极显著下调（P<0.01）;结肠ACE2、MasR的mRNA水平极显著上调（P<0.01）,结肠B0AT1 mRNA水平显著上调（P<0.05）,SGLT-1、GLUT-2的mRNA水平显著下调（P<0.05）,PEPT-1 mRNA水平下调不明显。5)腹泻保育猪十二指肠ACE2和Mas受体蛋白表达降低,AT1受体蛋白表达升高,且都不显著,ACE蛋白表达显著升高（P<0.05）;空肠ACE2蛋白表达显著降低（P<0.05）,Mas受体蛋白表达极显著降低（P<0.01）,ACE和AT1受体蛋白均极显著升高（P<0.01）;回肠ACE2和Mas受体蛋白表达降低,ACE和AT1受体蛋白表达升高,且都不显著;结肠ACE2和AT1受体蛋白表达均显著升高（P<0.05）,ACE和Mas受体蛋白表达升高但都不显著。结论:腹泻保育猪肠道处于炎症状态下,ACE/AT1轴活性相比ACE2/Mas轴占优势,肠道转运载体表达下调,氨基酸及葡萄糖转运受阻。其机制可能与肠道局部RAS失衡相关,高浓度Ang Ⅱ过多消耗了 ACE2,减少了 ACE2对氨基酸等转运载体的协助作用,使肠道物质转运能力降低,葡萄糖等物质吸收减少。2血管紧张素转化酶2（ACE2）影响猪小肠物质转运的机制研究实验通过构建Ang Ⅱ诱导猪肠上皮细胞（IPEC-J2）炎症损伤模型,探讨ACE2对猪小肠物质转运的作用机制。研究包括:1)Western blot及免疫荧光法确定细胞中ACE2的表达定位;2)Ang Ⅱ诱导建立IPEC-J2细胞炎症损伤模型;3)流式细胞术检测细胞中ROS的产生;ELISA法检测细胞上清中TNF-α、IL-8、IL-10,Ang Ⅱ、Ang（1-7）及总氨基酸和葡萄糖的含量;Western blot检测细胞中ACE2、MasR及ACE、AT1R蛋白表达水平;RT-qPCR分析细胞中B0AT1、SGLT-1、GLUT-2及PEPT-1蛋白mRNA的表达;4)外源添加ACE2活性蛋白:验证ACE2对Ang Ⅱ诱导细胞炎症损伤的作用;探究ACE2对细胞中氨基酸和葡萄糖等物质转运的影响。结果:1)IPEC-J2细胞中存在ACE2的表达,并定位于胞膜和胞浆内;2)成功构建了Ang Ⅱ诱导IPEC-J2细胞炎症损伤模型,确定诱导时间为6h;3)细胞中的ROS、促炎性因子TNF-α和IL-8及ACE和AT1R蛋白的表达均随Ang Ⅱ浓度的升高显著或极显著升高（P<0.05,P<0.01）,Ang（1-7）、抗炎性因子IL-10及ACE2和MasR蛋白的表达均显著或极显著降低（P<0.05,P<0.01）;高浓度Ang Ⅱ可诱使细胞中B0AT1和PEPT-1的mRNA水平极显著下调（P<0.01）,GLUT-2 mRNA水平显著下调（P<0.05）,SGLT-1 mRNA水平下调不明显;细胞中总氨基酸和葡萄糖的含量均显著降低（P<0.05）;4)外源添加ACE2活性蛋白:细胞中的ROS、Ang Ⅱ、促炎性因子TNF-α和IL-8的含量及ACE蛋白的表达均显著或极显著降低（P<0.05,P<0.01）,Ang（1-7）、抗炎性因子IL-10的含量及ACE2蛋白的表达均显著或极显著上升（P<0.05,P<0.01）;细胞中B0AT1 mRNA水平极显著上调（P<0.01）,PEPT-1和GLUT-2的mRNA水平均显著上调（P<0.05）,SGLT-1 mRNA水平上调不明显;细胞中总氨基酸和葡萄糖的含量均显著升高（P<0.05）。结论:Ang Ⅱ可引起IPEC-J2细胞炎症损伤,ACE2/MasR蛋白表达下调,胞内总氨基酸和葡萄糖的含量下降且相关转运载体表达下调;ACE2通过降解Ang Ⅱ抑制ACE-Ang Ⅱ-AT1R轴的活性,缓解了细胞炎症反应。ACE2过表达可以上调IPEC-J2细胞B0AT1、PEPT-1、GLUT-2及SGLT-1转运载体的表达,参与了小肠内氨基酸和葡萄糖等物质的转运。