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随着我国人口的增长,奶产品的需求日益增加,为了满足这些需求,现代奶牛养殖业经常集中大量饲喂奶牛,以增加奶产量。当奶牛大量集中时,很容易会产生一系列饲养管理问题,如挤奶、饲喂、接生等过程操作不当,就会使奶牛乳腺接触到大量病原微生物。这些微生物可以通过乳腺组织进入到血液,如革兰氏阴性菌的细胞壁会大量裂解产生一种刺激剂γ-D-谷氨酸-内消旋-二氨基庚二酸（iE-DAP）,激活细胞内相关受体NOD1,通过NOD1/NF-κB信号途径和Erk/Nrf2/HO1l信号途径分别引发奶牛乳腺的炎症和氧化应激反应,从而影响奶牛的免疫机能和生产性能。谷氨酰胺（GLN）是一种已被证明具有许多生物活性的氨基酸。它可以下调NF-κB活性和凋亡因子Caspase3,上调Erk活性和抗凋亡因子Bcl-2来增强包括抗炎,抗氧化应激和抗凋亡作用。本试验中,我们通过高通量测序,分析乳样品中细菌类型,根据其类型,建立iE-DAP诱导牛乳腺上皮细胞（BMEC）的炎症和氧化应激模型,探究iE-DAP对BMECs的NOD1/NF-κB通路和ERK/Nrf2通路的影响,以及谷氨酰胺在这些影响中的调控作用。1.高通量测序检测乳腺炎奶样品中细菌的丰度和多样性以采集的养殖场患有乳房炎奶牛奶样品中微生物为研究对象,利用Illumina HiSeq测序平台,利用双末端测序（PairedEnd）的方法进行测序,用不同分析方法分析奶样品中组成菌落的丰度和多样性。结果显示,患有乳腺炎奶牛奶样品的细菌过滤后一共产生1753626条高质量序列标签（Clean tags）,1677892条有效序列标签（Effective tags）以及1251条分类操作单元（OTU）。对样品的phylum水平进行OTU的聚类分析,做出柱状图和系统进化树,结果发现变形杆菌门占比最多,其次是厚壁菌门、脱铁杆菌门、放线杆菌门和拟杆菌门。其次患有乳房炎奶牛奶样品中的物种丰富度高,Chao1和Ace指数都显示出M14的物种丰富度最大,M21物种丰富度最小。Shannon和Simpson指数显示,M6的微生物多样性最大,M13的微生物多样性最小。样品稀释曲线显示,奶样品中有大量微生物被检测发现。且在环境中的物种已稳定存在,检测的微生物数量趋于饱和,可以被作为充分的判断。等级丰度曲线显示M14的曲线最宽,物种组成最丰富,M15的曲线最短,物种组成最少,所有曲线都不平坦,说明物种组成的均一度都不高。通过对31个患有乳房炎奶牛的奶样品分析,我们掌握了乳房炎微生物中的物种组成和优势菌落,为牧场的奶牛饲养和挤奶管理提供了建议,为奶牛预防给药也提供了方向。2.谷氨酰胺缓解iE-DAP诱导的牛乳腺上皮细胞的炎症、氧化应激和凋亡反应本试验旨在探究谷氨酰胺是否可以缓解iE-DAP诱导的牛乳腺上皮细胞炎症、氧化应激和凋亡反应。选用第五代到第十代之间的奶牛乳腺上皮细胞,先用不含谷氨酰胺的培养基饥饿培养24 h,再用不同时间（0、1、2、4、16 h）和不同浓度（1、10、50、100 μg/mL）的iE-DAP和不同浓度的GLN（0、2、4、8、16mM）处理细胞,用ELISA和免疫荧光PCR结果挑选最佳诱导炎症和氧化应激的iE-DAP浓度和GLN保护浓度。之后分为四组:对照组（CON）、iE-DAP处理组（DAP）、GLN保护组（DG）和GLN处理组（GLN）。SOD、MDA检测结果分别表明谷氨酰胺可以促进抗氧化因子SOD的分泌、减少氧化分泌物MDA分泌;免疫荧光PCR结果表明谷氨酰胺可以抑制炎性相关基因并促进抗氧化应激相关基因的表达;细胞流式分析结果表明,GLN抑制了iE-DAP诱导的细胞的凋亡。本试验表明,谷氨酰胺可以有效抑制由iE-DAP诱导的细胞炎症、氧化应激和细胞凋亡作用。3.谷氨酰胺缓解iE-DAP诱导牛乳腺上皮细胞的炎症、氧化应激和凋亡反应的信号通路本试验旨在探究谷氨酰胺对于iE-DAP诱导的牛乳腺上皮细胞炎症、氧化应激和凋亡反应的保护机制。选用第五代到第十代之间的奶牛乳腺上皮细胞,分为四组对照组（CON）、iE-DAP处理组（DAP）、谷氨酰胺保护组（DG）和谷氨酰胺处理组（GLN）,先用不含谷氨酰胺的培养基饥饿培养24h,用不同浓度谷氨酰胺（4,8mM）预处理,再用10μg/mLDAP分别处理2h和8h。实时荧光定量PCR结果表明,8 mMGLN可以降低DAP组细胞NOD1、NF-κB和IκB基因表达的升高;4mMGLN逆转DAP组细胞内Nrf2、HO-1表达的降低。Western blotting结果表明,8 mM GLN下调了iE-DAP处理后细胞中NOD1、pp65/p65、p-IκB/IκB和Caspase3蛋白表达水平的上升,上调了 Bcl-2蛋白表达水平;4mMGLN上调了iE-DAP诱导的ERK、Nrf2、HO-1蛋白表达水平的下降。免疫荧光分析结果表明,8 mMGLN缓解了 iE-DAP处理后的细胞中NOD1和p65抗体荧光含量的增多和细胞核中的聚集;4mM谷氨酰胺逆转了 iE-DAP 处理后的 细胞中 Nrf2 和 ERK 抗体荧光含量和 细胞核 中量的 减少。GLN可用作预防和保护牛乳腺炎的饲料添加剂。关于GLN对牛乳腺上皮细胞（BMEC）的作用机制知之甚少。因此探讨谷氨酰胺（GLN）保护牛乳腺上皮细胞免受γ-D-谷氨酸-内消旋-二氨基庚二酸（iE-DAP）诱导的炎症,氧化应激和细胞凋亡的影响和作用机制十分重要。