【摘 要】
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CRISPR技术的快速发展为枯草芽孢杆菌提供了诸多分子生物学工具。因此,建立及拓展枯草芽孢杆菌CRISPR系统具有重要研究意义。透明质酸作为大分子多糖,在医药、食品及化妆品的制各中有着广泛的应用。枯草芽孢杆菌被视为透明质酸生产的优良宿主,研究透明质酸在枯草芽孢杆菌的工业应用能力具有重要研究意义。本课题首先构建了 CRISPR-AsCpf1双质粒系统（pHT01-AsCpf1、pJOE-DRN23D
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CRISPR技术的快速发展为枯草芽孢杆菌提供了诸多分子生物学工具。因此,建立及拓展枯草芽孢杆菌CRISPR系统具有重要研究意义。透明质酸作为大分子多糖,在医药、食品及化妆品的制各中有着广泛的应用。枯草芽孢杆菌被视为透明质酸生产的优良宿主,研究透明质酸在枯草芽孢杆菌的工业应用能力具有重要研究意义。本课题首先构建了 CRISPR-AsCpf1双质粒系统（pHT01-AsCpf1、pJOE-DRN23DR）用于枯草芽孢杆菌的基因组编辑。其中,包含温敏型复制子reppE194ts的质粒pJOE-DRN23DR可快速高效地消除,优化了基因组编辑流程。应用此系统进行基因组敲除效率、敲入效率及大片段删除效率评估,最高编辑效率分别为:100%、92%、87%。随后,基于CRISPR-AsCpf1系统对枯草芽孢杆菌进行代谢工程改造合成透明质酸。第一,通过引入透明质酸合成途径（hasA敲入）及强化UDP-葡萄糖醛酸合成途径（tuaD敲入）获得菌株B.subtilis-HA03,透明质酸产量为0.96 g/L。第二,胞外多糖基因簇（epsA-O）及关键自溶基因（lytC）的连续敲除优化了底盘菌株,获得菌株B.subtilis HA05,将透明质酸产量提升至1.55 g/L。第三,通过UDP-乙酰氨基葡萄糖合成途径强化、糖酵解及磷酸戊糖途径调控优化透明质酸合成。其中UDP-乙酰氨基葡萄糖合成途径（glmU敲入）强化菌株B.subtilis-HA07进一步将透明质酸产量提升至2.27 g/L。最后,对菌株B.subtilis-HA07进行发酵优化。通过Plackett-Burman试验设计,筛选出对透明质酸生产影响最为显著的因素为蔗糖及酵母粉。最陡爬坡实验进一步优化蔗糖及酵母粉含量将透明质酸产量提升至4.64 g/L。最后优化诱导剂浓度及添加时间将透明质酸产量提升至4.72 g/L,透明质酸分子量为0.54×105 Da。3 L分批发酵HA产量为5.12 g/L。
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